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布魯氏桿菌(Brucella)熒光PCR試劑盒說明書

閱讀:255        發(fā)布時間:2024-11-25
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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:布魯氏桿菌(Brucella)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name:Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌屬(Brucella)引起的全-世界范圍內(nèi)流行的人畜共患病,。布魯氏桿菌可感染多種家畜和野生動物,,同時也可感染人,,特別是羊布魯氏桿菌對人的威脅最大,引起相似的臨床癥狀和病理損傷,,    如不孕-不育,、流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎及各種組織的局部病灶等,,導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1],。

本試劑盒適用于檢測羊種、牛種,、豬種和犬種血液,、動物組織或土壤、物體表面等標(biāo)本中的布魯氏桿菌,,

用于布魯氏桿菌感染的輔助診斷,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時熒光 PCR 技術(shù),設(shè)計(jì)一對布魯氏桿菌特異性引物,,結(jié)合一條特異性探針,, 用熒光 PCR 技術(shù)對布氏桿菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于科研實(shí)驗(yàn)中對可疑感染病料的病原學(xué)檢測,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

Brucella 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

Brucella 陽性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,,有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。

【標(biāo)本采集】

血液標(biāo)本:抽取動物靜脈血 3 mL~5 mL 放入帶蓋的 EDTA 抗凝管中并做好標(biāo)記送檢,。

動物組織標(biāo)本:無菌操作取動物的肝、脾組織 2 g~5 g,,放入無菌容器中,,并標(biāo)記取樣日期及部位。土壤或粉末狀標(biāo)本:無菌操作用采樣勺取 2 g~5 g  標(biāo)本置于無菌容器中密封保存,。

物體表面標(biāo)本:采用無菌生理鹽水濕潤的無菌拭子擦拭物體表面(以 100 cm2 為宜),,放入無菌容器中保存。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h,;若需長期保存,,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次,。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

血液標(biāo)本:無需前處理,,可直接用于 DNA 提取,。

動物組織標(biāo)本取 0.25 g 標(biāo)本,加人 0.5 mL 無菌生理水,勻漿,,靜置 10 min,取上清液備用。

土壤或粉末狀標(biāo)本:取 0.25 g 標(biāo)本,,加入 0.5 mL 無菌生理鹽水,,振蕩搖勻,,靜置 10 min,取上清液備用,。

物體表面標(biāo)本:采集的標(biāo)本用 0.5 mL 無菌生理鹽水洗滌,,振蕩搖勻,,靜置 10 min,取上清液備用,。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑(離心柱法)進(jìn)行核酸提取,,請按照試劑說明書    進(jìn)行操作。

2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),,設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿

10 份,,多配制 1 份),,每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑Brucella 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,,20μL/管,。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,,混勻,, 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),;

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM,, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,,ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光,選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min

245 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15,、End 值可設(shè)在 5~20,,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),,點(diǎn)擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,; 陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值,,且無特異性擴(kuò)增曲線;

可疑:樣本檢測結(jié)果 40<Ct 值≤45,,建議重復(fù)檢測,,如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45,且曲線有明顯的增長曲線,,判定為陽性,,否則為陰性。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示,;

陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,,否則實(shí)驗(yàn)視為無效,。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),;

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,;

3.陽性對照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,;

4.病原體在流行過程中基因突變,、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,;

6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果,;

7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,;

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心,;

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,;

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊,;

5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,;

6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,,以免交叉污染,;

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理,。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王利清. 布氏桿菌病的診斷及防控[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備, 2011.

[2]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1088-2010 布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[3]GB/T 18646-2018,  動物布魯氏菌病診斷技術(shù)[S].

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