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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：布魯氏桿菌（Brucella）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌屬（Brucella）引起的全-世界范圍內(nèi)流行的人畜共患病,。布魯氏桿菌可感染多種家畜和野生動物,，同時也可感染人,，特別是羊布魯氏桿菌對人的威脅最大，引起相似的臨床癥狀和病理損傷,，    如不孕-不育,、流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎及各種組織的局部病灶等,，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1],。

本試劑盒適用于檢測羊種、牛種,、豬種和犬種血液,、動物組織或土壤、物體表面等標(biāo)本中的布魯氏桿菌,，

用于布魯氏桿菌感染的輔助診斷,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對布魯氏桿菌特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針,， 用熒光 PCR 技術(shù)對布氏桿菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于科研實(shí)驗(yàn)中對可疑感染病料的病原學(xué)檢測,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

Brucella 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

Brucella 陽性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。

【標(biāo)本采集】

血液標(biāo)本：抽取動物靜脈血 3 mL~5 mL 放入帶蓋的 EDTA 抗凝管中并做好標(biāo)記送檢,。

動物組織標(biāo)本：無菌操作取動物的肝、脾組織 2 g~5 g,，放入無菌容器中,，并標(biāo)記取樣日期及部位。土壤或粉末狀標(biāo)本：無菌操作用采樣勺取 2 g~5 g  標(biāo)本置于無菌容器中密封保存,。

物體表面標(biāo)本：采用無菌生理鹽水濕潤的無菌拭子擦拭物體表面(以 100 cm2 為宜),，放入無菌容器中保存。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h,；若需長期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次,。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

血液標(biāo)本：無需前處理,，可直接用于 DNA 提取,。

動物組織標(biāo)本取 0.25 g 標(biāo)本,加人 0.5 mL 無菌生理水，勻漿,，靜置 10 min,取上清液備用。

土壤或粉末狀標(biāo)本：取 0.25 g 標(biāo)本,，加入 0.5 mL 無菌生理鹽水,，振蕩搖勻,，靜置 10 min，取上清液備用,。

物體表面標(biāo)本：采集的標(biāo)本用 0.5 mL 無菌生理鹽水洗滌,，振蕩搖勻,，靜置 10 min，取上清液備用,。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進(jìn)行核酸提取,，請按照試劑說明書    進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

10 份,，多配制 1 份),，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑Brucella 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，20μL/管,。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15,、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點(diǎn)擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值,，且無特異性擴(kuò)增曲線；

可疑：樣本檢測結(jié)果 40＜Ct 值≤45,，建議重復(fù)檢測,，如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45，且曲線有明顯的增長曲線,，判定為陽性,，否則為陰性。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效,。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

3.陽性對照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

4.病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果,；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心,；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；

5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染,；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理,。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王利清. 布氏桿菌病的診斷及防控[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備, 2011.

[2]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1088-2010 布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[3]GB/T 18646-2018,  動物布魯氏菌病診斷技術(shù)[S].