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【產(chǎn)品名稱】

 商品名稱：百日咳桿菌(BP)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name： Bordetella pertussis Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

百日咳是由百日咳鮑特菌（Bordetella pertussis, BP）引起的兒童急性傳染病,。我國在實施計劃免疫后,，其發(fā)病率下降至<1/10 萬,。該病四季均有發(fā)生，春夏季多發(fā),，典型癥狀為陣發(fā)性,、痙攣性咳嗽，持續(xù)咳嗽≥2 周,； 非典型癥狀為嬰兒有反復發(fā)作的呼吸暫停,、窒息、青紫和心動過緩癥狀,，或有間歇的陣發(fā)性咳嗽,。

本試劑盒適用于檢測檢測患者痰、鼻咽拭子等樣本中的百日咳桿菌 DNA,，適用于百日咳桿菌感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查,，其檢測結果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,，設計一對百日咳桿菌的特異性引物,，結合一條特異性熒光探針，用熒光 PCR 技術對百日咳桿菌 DNA 進行體外擴增檢測,，用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

BP 反應液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

BP 陽性質(zhì)控品250μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存,、運輸、反復凍融不超過 5 次,，有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。

【標本采集】

采集病人痰液或咽拭子標本，咽拭子應使用專用采樣拭子,，適度拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位,，應避免   觸及舌部,；迅速將拭子放入標本采集管中，旋緊管蓋并密封,，以防干燥,。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存,，凍融不超過 3 次,。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取 100μL 痰或鼻咽拭子標本于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取,，請按照試劑說明書進行操作,。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑BP 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管,。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；

4.2設置好通道,、樣品信息，反應體系設置為 25μL,；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycle95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15,、End 值可設在 5～20,，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線）,，點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,； 陰性：樣本檢測結果無 Ct 值，且無特異性擴增曲線；

可疑：樣本檢測結果 40＜Ct 值≤45,，建議重復檢測,，如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45，且曲線有明顯的增長曲線,，判定為陽性,，否則為陰性。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效,。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理,、運送以及保存質(zhì)量有關,；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果,；

3.陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果,；

4.病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導致假陰性結果,；

5.不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考,，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6.樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。

【參考文獻】

[1]中國人民共和國衛(wèi)生部. WS 274-2007 百日咳診斷標準[S].

[2]王慧, 羅煒, 賴克方. 實時熒光定量 PCR 快速檢測百日咳鮑特菌方法學建立及評價[J]. 臨床檢驗雜志, 2010, 28（6）: 407-409.

[3]黃玉蓉. 聚合酶鏈反應檢測技術在百日咳診斷中應用價值的探討[J]. 新疆醫(yī)科大學 , 2007.