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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：腸炎沙門氏菌(SE)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name ：Salmonella Enteritidis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒

【預期用途】

腸炎沙門氏菌不但能引起肉雞和蛋雞的發(fā)病,，造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且是人食物中毒的主要病原菌之一,。    日、美等發(fā)達國家發(fā)生食物中毒事件 40%-80%是由禽沙門氏菌引起的，其中主要病原菌為腸炎沙門氏菌,，也是我國食物中毒事件的常見菌。由于該菌引起雞群發(fā)病的癥狀和病理學冰花與雞白痢沙門氏菌非常相似,，所以在生產(chǎn)中往往把雞腸炎沙門氏菌感染誤診為雞白痢或傷寒,。但 SE 宿主譜比白痢沙門氏菌廣泛，該病的防治和普查要比雞白痢困難的多,，建立腸炎沙門氏菌快速特異性檢測方法在養(yǎng)殖業(yè),，醫(yī)學以及公共衛(wèi)生有重要意義。

腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis, SE）是引起人與動物急性胃腸炎的主要病原菌,，感染后典型癥狀包括發(fā)熱,、腹瀉等。SE 具有廣泛寄主譜,，

本試劑盒適用于檢測水樣糞便,，疑似污染的水、食物等樣本中的雞腸炎沙門氏菌,，用于雞腸炎沙門氏菌感   染的輔助診斷,。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對雞腸炎沙門氏菌特異性引物,，結合一條特異性探針,，用熒光 PCR 技術對雞腸炎沙門氏菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

SE 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

SE 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。

【標本采集】

水樣便取 0.5~1mL；疑似污染的食物取 1g

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h,；若需長期保存,，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次,。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

水樣便 13000rpm 離心 2min,，去盡上清；疑似污染的食物用手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,， 加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；疑似污染的水直接取 100μL,。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取,，   請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：

試劑SE 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸,、陽性質控品,、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻， 短暫離心,。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi),；

4.2設置好通道,、樣品信息，反應體系設置為 25μL,；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM,，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置,，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20,，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果,。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值,。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集,、處理,、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果,；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果,；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,，會導致假陰性結果,；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果,；

6.試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；

7.本檢測結果僅供參考,，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,，以免交叉污染,；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理,。