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【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名稱(chēng)：鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

鴨瘟，又稱(chēng)鴨病毒性腸炎,，是由皰疹病毒科鴨瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV） 引起的一種急性（有時(shí)呈慢性）鴨,、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高,，兩腿麻痹,，下痢，流淚和部分病鴨頭頸腫大,。食道粘膜有小出血點(diǎn),，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋,。肝有不規(guī)則大小不等的出血點(diǎn)和壞死灶[1],。本病傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高,，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展,。

本試劑盒適用于檢測(cè)病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液,、肝,、脾、腎等組織樣品   等樣本中的鴨瘟病毒,，用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)鴨瘟病毒基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)鴨瘟病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

名稱(chēng)規(guī)格

酶液50μL×1 管

DPV 反應(yīng)液500μL×2 管

DPV 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù),。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI ,、安捷倫 MX3000P/3005P,、LightCycler、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。

【標(biāo)本采集】

在發(fā)病早期，無(wú)菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液,；在動(dòng)物死亡后,，無(wú)菌采取肝、脾,、腎等組織樣品

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月,，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；粘液直接取 100μL 提取

1.2DNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取

法）,，請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；樣品每滿(mǎn) 7 份,，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑DPV 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管,。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA,、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye） NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,，當(dāng)曲線(xiàn)出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35,，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38,，建議重復(fù)檢測(cè),，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38， 且曲線(xiàn)有明顯的增長(zhǎng)曲線(xiàn),，判定為陽(yáng)性,，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值,。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示,；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.檢測(cè)方法的局限性

?樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

?樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,；

?陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,；

?病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

?不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

?試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定   量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；

?本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服,；

6.樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通   則》進(jìn)行處理,。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T-2744-2010 鴨病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010.

[2]索化夷, 湯承, 岳華, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan-PCR 檢測(cè)鴨瘟病毒方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2006.

[3]馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量 PCR 檢測(cè)方法的建立及其強(qiáng)弱毒株 UL2 基因差異分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.