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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：雞毒支原體(MG)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)

Name ：Mycoplasma gallisepticam Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum, MG）是引起雞慢性呼吸道疾病的主要病原，引起雞呼吸道粘膜卡他性炎癥,，造成肉雞胴體品質(zhì)下降,，種雞產(chǎn)蛋率,、受精率和孵化率下降等。MG 是高度傳染性病原,，可隨塵粒,、空氣和羽毛在雞群中水平傳播，也可隨種蛋垂直傳播,。MG 定植雞的呼吸道后,，導(dǎo)致呼吸道上皮細(xì)胞纖毛活動(dòng)減弱或停滯，引起雞群繼發(fā)大腸桿菌感染或雞新城疫病毒,、傳染性支氣管炎病毒感染,，引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，導(dǎo)致雞群死亡率增高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,。

本試劑盒適用于檢測(cè)鼻腔,、眶下竇、氣管或氣囊組織,、眶下竇和關(guān)節(jié)滲出物或結(jié)膜囊內(nèi)沖洗物,、鼻腔、食   管,、氣管,、泄殖腔和交合器拭子、卵黃囊內(nèi)表面等樣本中的雞毒支原體,，用于雞毒支原體感染的輔助診斷,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)雞毒支原體基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)雞毒支原體的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

MG 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

MG 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存,、運(yùn)輸,、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月,。

【適用儀器】

ABI7500,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽,，從鼻腔、眶下竇,、氣管或氣囊取樣,，也可吸取眶下竇和關(guān)節(jié)滲出物或結(jié)膜囊內(nèi)沖洗物；活   禽從鼻腔,、食管,、氣管、泄殖腔和交合器中取樣,；雞胚從卵黃囊內(nèi)表面,、口咽和氣囊采樣。

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h,；若需長(zhǎng)期保存,，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過(guò) 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL滅菌離心管中；液體樣品,，直接取 100μL 提取,。

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書(shū)    進(jìn)行操作,。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑MG 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管,。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸,、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,， 短暫離心,。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置,，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值,、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20,，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線）,，點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤40,，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線,； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無(wú) Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)特異性擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示,；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效,。

6.檢測(cè)方法的局限性

樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,；

陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；

本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段,。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心,；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊,；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染,；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理,。