您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
6
| 純度 | 99% | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
|---|---|---|---|
| 規(guī)格 | 25T/50T | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 病毒檢測 |
產(chǎn)品簡介
詳細介紹
禽.流感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）
【包裝規(guī)格】 25頭份/盒 & 50頭份/盒
【預期用途】
禽流.感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）利用實時熒光PCR原理，定性檢測禽.流感病毒H7N9亞型（AIV-H7N9）,，對AIV-H7N9引起的禽.流感的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義,。
【檢驗原理】
禽流.感病毒H7N9亞型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）針對AIV-H7N9高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含AIV-H7N9基因組模板的情況下,，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析,。
注：陰性對照為禽類基因組DNA,，陽性對照為失去活性的AIV-H7N9病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復凍融,有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 ,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,，采集方法如下：
咽喉拭子,，采取時要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液,；將咽喉拭子放人盛有1.0mL生理鹽水的離心管中備用,，應避免標本間交叉污染。
2.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過 夜保存；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃,，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
根據(jù)需要,，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5 μl,，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序,。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 AIV-H7熒光信號 HEX通道采集 AIV-N9熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,，設置淬滅基團選擇None
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性，否則為陰性,。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 | |
FAM | HEX | |
+ | + | 樣本中檢測出AIV-H7和AIV-N9 |
+ | - | 樣本中檢測出AIV-H7，未檢測出AIV-N9 |
- | + | 檢測出AIV-N9,，未檢測出AIV-H7,。 |
- | - | 未檢測出AIV-H7和AIV-N9。 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的*檢出*可能會發(fā)生假陰性的結果,。
2. 被檢樣本在采集,、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果,。
3. 樣本在采集,、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結果,。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的*檢出限為102 Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,，各區(qū)實驗服、儀器,、耗材應獨立使用,，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置,。
2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理,。
3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照,。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第1次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),，并單獨存放,。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,。
化工儀器網(wǎng)