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樣本來源
對于IHC,組織是來自患者或動(dòng)物,,經(jīng)過冷凍或石蠟包埋,。然后切成約4μm厚的切片。對于ICC,,大部分細(xì)胞外基質(zhì)被去除,,只剩下整個(gè)細(xì)胞來染色,來源可以是細(xì)胞懸液,,或組織培養(yǎng)細(xì)胞系,。
然而IHC遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于把抗體放在組織切片上、然后用顯微鏡觀察那么簡單,。要想得到實(shí)用,、可靠而清晰的結(jié)果,就需要耐心的對每一步進(jìn)行優(yōu)化,。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法和免疫酶法,,R&DSystems的網(wǎng)站列出了IHC/ICC實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化的變量及影響因素如下:
樣本類型:組織或細(xì)胞
樣本制備:組織(石蠟或冰凍),細(xì)胞:(貼壁細(xì)胞或細(xì)胞懸液)
適當(dāng)對照:無一抗,,組織類型,。
固定方法:灌注或浸泡。
固定劑:甲醛,,醇類,,丙酮。
封閉液:正常血清,,牛血清蛋白(BSA)或脫脂奶粉,。
抗原修復(fù):蛋白酶,加熱,。
檢測方法:直接或間接
一抗:物種
二抗:物種
標(biāo)記物:熒光或酶(顯色)
復(fù)染劑:蘇木精或DAPI(熒光)
封片劑:抗淬滅或水性
顯微鏡觀察:熒顯微鏡或光學(xué)顯微鏡
處理不同樣本的區(qū)別
ICC需要透化,,要么通過固定過程,要么是單獨(dú)的透化步驟,,而IHC可能不需要單獨(dú)的透化步驟,,這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的組織樣本在抗體染色前需要進(jìn)一步處理,。一旦處理好樣品,,IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。
樣本固定和制備
組織石蠟包埋前的組織固定:4%甲醛固定劑是組織灌注和浸潤固定的常用溶液,,一般需要4–24h,,能很好地保留組織形態(tài),切片機(jī)切片,,貼附于載玻片干燥,,石蠟切片存儲室溫多年,,后續(xù)進(jìn)行IHC/ICC之前需要再水化,需要抗原修復(fù),。
培養(yǎng)細(xì)胞固定:2%甲醛室溫固定20min,,細(xì)胞樣本貼附載玻片,對于貼壁細(xì)胞直接放在6孔或24孔底部的無菌載玻片上生長,,懸浮細(xì)胞可通過與包被多聚賴氨酸的載玻片孵育10min而附著在載玻片上,。
冰凍組織切片固定:切片后用醇類固定,用于檢測磷酸化依賴的表位,,在低溫箱進(jìn)行樣本切片,,冰凍切片存儲–80℃多達(dá)一年。通常保留酶的活性和抗原功能,,不需要抗原修復(fù),,冰晶的形成可能負(fù)面影響組織結(jié)構(gòu)。
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