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毓秀生物科技(上海)有限公司

免疫印跡法

時間:2019-5-7閱讀:4034

Western blot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體,然后用這種多肽的特異抗體來檢測,。

Western blot的中文名稱是:蛋白質(zhì)印跡,也叫免疫印跡(immunoblotting),。是分子生物學(xué)中常用的三種印跡技術(shù)之一,。目前*的該實驗技術(shù)的發(fā)明人為美國斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克(George Stark),。

Western blot——蛋白質(zhì)印跡

Southern blot——DNA印跡

Northern blot——RNA印跡

Western blot 優(yōu)點

高分辨率的電泳技術(shù)

特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western blot應(yīng)用

目的蛋白的表達(dá)特性分析

目的蛋白與其它蛋白的互作

目的蛋白的組織定位

目的蛋白的表達(dá)量分析

Western blot 流程

一、蛋白樣品的提取

提取細(xì)胞中的蛋白多是利用將細(xì)胞裂解,、破碎,、使蛋白質(zhì)釋放的原理。其中裂解液應(yīng)該新鮮制備,,加入少量的蛋白酶抑制劑以減少蛋白的降解,,并且分裝凍存于-80℃,蛋白酶抑制劑的種類很多,,要根據(jù)具體情況選擇,。

目的:要獲得高豐度、高品質(zhì)的蛋白質(zhì),,以滿足后續(xù)實驗的需求,。

二、蛋白樣品的定量

Western blot作為一項半定量實驗技術(shù),,電泳前,,必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;

蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高則會使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪Α?/span>

目前常用比色法測定樣品蛋白的含量:Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)、Lowry法(Folin-酚試劑法),、BCA法等,。

三、蛋白樣品的變性

1M Tris-HCl(pH6.8)

10 ml

1M  DTT

20 ml

SDS

4 g

甘油

20 ml

溴酚藍(lán)

0.2 g

總體積

100ml

全部配好分裝,,-20℃凍存,。

1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合,95100℃加熱515min,,冰上冷卻后再上樣,,上樣量一般為20-25μl,總蛋白量2050μg,。

SDS

陰離子去污劑   變性劑

氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束,。

蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,,消除了不 同分子之間原有的電荷差異。

與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵,、疏水鍵打開,,使蛋白質(zhì)分子線性化。

蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點:

不連續(xù)的電泳緩沖體系,。

SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時,不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響,,而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小,。

SDS聚丙烯酰胺凝膠配制及蛋白分離范圍

灌膠
灌制分離膠 隔絕空氣 灌制濃縮膠  插入梳子                 

四、電泳

加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣,。(電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品(Marker 5-10ul ;樣本:10 ul ),。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出,。加入下一個樣品時,,進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染,。

采用恒壓的方法:1.恒壓60V,,至樣本跑過 濃縮膠;2.將電壓調(diào)至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,,準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。

五、轉(zhuǎn)膜

凝膠電泳結(jié)束后,,將凝膠上分離的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上,,常用的固相支持物有NC (硝酸纖維素)膜、尼龍膜及PVDF(聚偏氟乙烯)膜,。

選擇膜的主要根據(jù)有:

1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力(也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量)

2.膜的孔徑(也就是攔截蛋白的大?。?/span>

3.不影響后續(xù)的顯色檢測(也就是適合用于所選顯色方法,信噪比好)

4.如果后繼實驗有其他要求,,比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析,,還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜

濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備濾紙和1張轉(zhuǎn)印膜。切濾紙和膜時一定要戴手套,,因為手上的蛋白會污染膜,。轉(zhuǎn)膜前,轉(zhuǎn)印膜以及濾紙均需浸潤在電轉(zhuǎn)液中活化15-20min(其中PVDF膜需在無水甲醇中活化30min后再浸潤于電轉(zhuǎn)液中,,且濾紙應(yīng)與膠和膜的大小一致),。

將玻板輕輕撬開,,將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉(zhuǎn)液中。從陰極到正極,,按照三層濾紙   凝膠 轉(zhuǎn)印膜 三層濾紙的順序制成“三明治”(濕轉(zhuǎn)在三明治的兩側(cè)各加一層活化過的海綿,,同時應(yīng)注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡),。

半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

六,、轉(zhuǎn)膜后檢測

轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白,,將膜晾干備用,。

將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色,觀察凝膠中的蛋白是否*轉(zhuǎn)至印跡膜上,。

七,、封閉,結(jié)合一抗,,結(jié)合二抗,。

封閉

為避免作為檢測試劑的特異性抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合,使非特異性背景提高,,需對膜上的潛在結(jié)合位點進(jìn)行封閉處理,。

5%脫脂奶粉或BSA(室溫孵育1h

Tween-20的作用:減少非特異性吸附,不影響抗體與抗原的結(jié)合,。

一抗孵育

把膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中,,根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液,搖床上平緩搖動,,于室溫孵育1-2小時或4℃過夜,。

回收一抗溶液,用TBST漂洗膜3次,,每次10min,。

二抗孵育

加入二抗,搖床上緩慢搖動,,于室溫孵育1-2小時或4℃過夜,。

TBST漂洗膜3次,每次10min,。

后用TBS漂洗膜2次,,每次10min

八,、固相免疫檢測

利用ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)發(fā)光檢測目的蛋白,。

ECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理:

發(fā)光液AB分別是魯米諾和過氧化氫,在辣根過氧化物酶(HRP)的催化作用下,魯米諾與過氧化氫反應(yīng)生成一種過氧化物,,過氧化物不穩(wěn)定隨即分解,,形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài),,就會產(chǎn)生熒光。

九,、Western blot結(jié)果分析

目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差,,所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

內(nèi)參的選擇

內(nèi)參即是內(nèi)部參照,,對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白,,它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定,一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參,。

內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用,,只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下,目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義,表明的確是實驗設(shè)計的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化,,而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化。

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