層析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展,，對于植物各類化學(xué)成分的分離鑒定工作起到重大的推動作用,。如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮Ⅰ,、Ⅱ,、Ⅲ。但以后進一步的研究,，發(fā)現(xiàn)除丹參酮Ⅰ為純品外,，Ⅱ、Ⅲ,、均為混合結(jié)晶,。此后通過各種層析方法，迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體（其中有4種為我國發(fā)現(xiàn)）。新的層析技術(shù)不斷發(fā)展,，隨著層析理論和電子學(xué),、光學(xué)、計算機等技術(shù)的應(yīng)用,，層析技術(shù)已日趨完善,。
一、層析法的基本原理： 層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相"溶劑之間的分配系數(shù)之差（分配層析）,，組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析）,，和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x,。通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析,。
一,、吸附層析法（AdsorptionChromatography）
（一）吸附劑,、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系：液一固吸附層析是運用較多的方法,，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離,，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離,。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑,、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)三因素。
1. 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠,、氧化鋁、活性炭,、硅酸鎂,、聚酰胺,、硅藻土等。
?。?） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì),，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu),，同時在顆
粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關(guān),。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分,，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17％,，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑,。對硅膠的活化，當硅膠加熱至100～110℃時,，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫度升高至500℃時,，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往,，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性,。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。
硅膠是一種酸性吸附劑,，適用于中性或酸性成分的層析,。同時硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子,，當遇到較強的堿注化臺物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物,。
（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分）,，對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想,。但是堿性氧化鋁不宜用于醛,、酮,、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離,。因為有時堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應(yīng)，如異構(gòu)化,、氧化、消除反應(yīng)等,。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁,。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離,。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì),，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì),，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁,。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的,，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目,，分離效果差：小于160目,，溶濃流速大慢,，易使譜帶擴散,。樣品與氧化鋁的用量比,，一般在1：20～50之間層析柱的內(nèi)徑與柱長比例在1：10-20之向,。
在用溶劑沖洗柱時,，流速不宜過快,，洗脫液的流速一般以每半～1小時內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。
?。?）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌,，其次用乙醇洗，再以水洗凈,，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭,，選用顆粒活注炭,，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱,，以免流速太慢,?；钚蕴恐饕矣诜蛛x水溶性成分,，如氨基酸,、糖類及某些甙?；钚蕴康挠袨槲阶饔茫谒芤褐衵ui強,，在有機溶劑中則較低弱,。故水的洗脫能力zui弱，而有機溶劑則較強,。例如以醇-水進行洗脫時,，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加,。活性炭對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別,，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開,，單糖與多糖分開,，氨基酸與多肽分開,。
2.溶劑：層析過程中溶劑的選擇,，對組分分離關(guān)系極大,。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱洗脫劑,，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇,，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì),，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑,；被分離物質(zhì)為強極性成分,，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠）,，則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低,。
在柱層操作時,，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的,，以便被分離的成分可以被吸附,。然后漸增大溶劑的極性,。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程,，稱為“梯度洗脫"，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫,。如果極性增大過訣（梯度太大）,，就不能獲得滿意的分離,。溶劑的洗脫能力,，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（ε）來表示。介電常數(shù)高,，洗脫能力就大,。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠,、氧化鋁,。對非極性吸附劑，如活性炭,，則正好與上述順序相反,，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強,。
3.被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑,，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素,，彼此緊密相連。在的吸附劑與洗脫劑的條件下,，各個成分的分離情況,，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān),。對極性吸附劑而言,，成分的極性大，吸附住強,。
當然,，中草藥成分的整體分子觀是重要的,，例如極性基團的數(shù)目愈多,，被吸附的住能就會大些,，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會強些,。總之,，只要兩個成分在結(jié)構(gòu)上存在差別,，就有可能分離,，關(guān)鍵在于條件的選擇,。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強度,，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來考慮,。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性,。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯,，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑,，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫,。但多數(shù)中藥成分的極性較大,，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般Ⅲ～Ⅳ級）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增,，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況,。此外,，能否獲得滿意的分離,，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系?，F(xiàn)以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系,。如有多組分的混合物,，象植物油脂系由烷烴,、烯烴、舀醇酯類,、甘油三酸醋和脂肪酸等組份,。當以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫,，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。
又如對于C-27甾體皂甙元類成分,，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5％的苯中,，加于氧化鋁的吸附柱上,，采用以下的溶劑進行梯度洗脫,。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁,，由于硅酸鎂的吸附性較弱,，洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低,，亦即采用苯或含5％的苯,，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來,。這一例子說明,，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時,，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果,，從而說明吸附劑,、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系,。
?。ǘ┎緦訉游觯罕訉游鍪且环N簡便,、快速,、微量的層析方法,。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上,，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析,。其原理與柱層析基本相似,。
1.薄層層析的特點：薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點與柱層析的比較,。
2.吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同,。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細,，一般應(yīng)小于250目,，并要求粒度均勻,。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過高,，以Ⅱ～Ⅲ級為宜,。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定,，薄層粒度越細,，展開距離相應(yīng)縮短,，一般不超過10厘米,，否則可引起色譜擴散影響分離效果,。
3.展開劑的選擇：薄層層析,，當吸附劑活度為一定值時（如Ⅱ或Ⅲ級）,，對多組分的樣品能否獲得滿意的分離,，決定于展開劑的選擇,。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中,，大致可按其極性不同而無極性,、弱極性、中極性與強極性,。但在實際工作中,，經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小,，對展開劑的極性予以調(diào)整。 4·特殊薄層：針對某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出,，有時需采用一些特殊薄層,。
?、?熒光薄層：有些化合物本身無色,，在紫外燈下也不顯熒光,，又無適當?shù)娘@色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進行層析,。展層后置于紫外光下照射,，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光,，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無機物,。其一是在 254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激潔的硅酸鋅,。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬,。
② 絡(luò)合薄層：常用的有硝酸銀薄層,，用來分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物,，如不飽和醇、酸等,。其主要機理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物，而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合,。因此在硝酸銀薄層上,，化臺物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由于吸附zui弱而Rfzui高,，含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高,，含一個三鍵的較含一個雙鍵的Rf值高,。此外,，在一個雙鍵化臺物中,，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進行。因此,，還可用來分離順反異構(gòu)體,。
③ 酸堿薄層和PH緩沖薄層：為了改變吸附劑原來的酸堿性,，可在鋪制薄層時采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層,。例如硅膠帶微酸性,，有時對堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾,，則可在鋪薄層時,，用稀堿溶液0.1～0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時,，丙酮一甲醇（8：2：1）為展開劑Rf＜0.1,，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0.4左右,。說明豬屎豆堿為——堿性生物堿,。 5.應(yīng)用：薄層層析法在中草藥化學(xué)成分的研究中，主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試,、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件,。
用薄層層析法進行中草藥化學(xué)成分預(yù)試，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件,，有針對性地進行,。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離,，選擇性高,，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。
以薄層層析法進中草藥化學(xué)成分鑒定,，要有標準樣品進行共薄層層析,。如用數(shù)種溶劑展層后，標準品和鑒定品的Rf值,、斑點形狀顏色都*相同,，則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對,。
用薄層層析法探索柱層分離條件,，是實驗室的常規(guī)方法。在進行柱層分離時,，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑,。在洗脫過程中各個成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體,，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗,。通過薄層的預(yù)分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對含量,。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件,，即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經(jīng)適當改變，轉(zhuǎn)至一般往層所采用洗脫的方式進行制備柱分離,。利用薄層的預(yù)分離尋找柱層的洗脫條件時,，假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由于在薄層展開時,，薄層固定相中所含的溶劑經(jīng)過不斷的蒸發(fā),，而使薄層上各點位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分,。但若嚴格控制層析操作條件,，則可得到接近真實的Rf值。用薄層進行某一組分的分離,，其Rf值范圍,，一般情形下為0.85＞Rf＞0.05.此外，薄層層析法亦應(yīng)用于中草藥品種,、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查,、質(zhì)量控制和資源調(diào)查，對控制化學(xué)反應(yīng)的進程,，反應(yīng)副產(chǎn)品產(chǎn)物的檢查,，中間體分析，化學(xué)藥品及制劑雜質(zhì)的檢查,，臨床和生化檢驗以及毒物分析等,，都是有效的手段。
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