微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來,，產(chǎn)率有了很大的提高，然而防止雜菌污染的要求也更高了,。人們在與雜菌污染的斗爭中,，積累總結出很多寶貴的經(jīng)驗。規(guī)范了管理措施,，設計了一系列設備(例如密閉式發(fā)酵罐,，培養(yǎng)基滅菌設備,，無菌空氣制備設備等)和管道,，應用了無菌室甚至無菌車間，建立了無菌操作技術,，因而大大降低了發(fā)酵染菌率,。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅，染菌后輕者影響產(chǎn)率,、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質量,，重者造成“倒罐” ，不但浪費大量原材料,，造成嚴重的經(jīng)濟損失,，還會對周圍環(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染,，及早發(fā)現(xiàn)雜菌并采取相應措施,，對減少由雜菌污染造成的損失至關重要。 

 

因此檢查的方法要求準確,、快速,。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個時期。種子培養(yǎng)期染菌的危害大,，因嚴格防止,。一旦發(fā)現(xiàn)種子染菌，均應滅菌后棄去,，并對種子罐及其管道進行*滅菌,。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富，容易染菌,，此時養(yǎng)分消耗不多,，應將發(fā)酵液補足必要養(yǎng)分后迅速滅菌，并重新接種發(fā)酵,。發(fā)酵中期染菌不但嚴重干擾生產(chǎn)菌株的代謝,，而且會影響產(chǎn)物的生成,，甚至使已形成的產(chǎn)物分解。 

 

由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗,，代謝產(chǎn)物的生成又不是很多,，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑,。如果是發(fā)酵后期染菌,，此時產(chǎn)物積累已較多，糖等養(yǎng)分已接近耗盡,，若染菌不嚴重,，可繼續(xù)進行發(fā)酵;若污染嚴重，可提錢放罐,。染菌程度越重,，危害越大;染菌少，對發(fā)酵的影響就小,。所以,，實際生產(chǎn)中，應當根據(jù)污染程度和發(fā)酵時期區(qū)別對待,。 

 

一,、實驗器材與試劑 

 

1.器材 

 

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺,、帶搖床的培養(yǎng)箱,、顯微鏡、天平,、三角瓶,、試管、移液管,、培養(yǎng)皿,、 接種針、平板涂布器,、酒精燈,、載玻片 

 

2.試劑 

 

營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖,、磷酸二氫氨,、七水合硫酸鎂、氯化鈉,、磷酸氫二鉀,、牛肉gao、蛋白胨,、0.4%酚紅溶液,、蒸餾水,、番紅染液、香柏油,、擦鏡液 

 

3.培養(yǎng)基 

 

(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：直接稱量營養(yǎng)瓊脂粉4.5g,，溶于100mL蒸餾水配制，pH 7.2,，分裝到試管中,，滅菌后擺成斜面。 

 

(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%,、磷酸二氫氨0.1%,、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉0.5%,、磷酸氫二鉀0.1% 

 

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉gao0.3%,、蛋白胨0.8%、葡萄糖 0.5%,、氯化鈉0.5%,、0.4% 酚紅溶液,，pH 7.2 

 

二,、實驗方法 

 

1.種子的擴大培養(yǎng) 

 

①斜面培養(yǎng)基的配制 配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分裝,，滅菌(121℃條件下滅菌 30min),，倒斜面。 

 

②菌種的活化 

 

⑴將大腸桿菌采用無菌操作的方法接種于斜面上,，37℃下培養(yǎng)18h; ⑵培養(yǎng)18h后,，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色,，挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進行無菌檢測;若顏色有黃有白,，則兩種顏色的菌落均要進行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢,，若檢測后,，沒有污染，便可進行擴大培養(yǎng);若檢測到雜菌,，要重復上述步驟,，直到無菌為止，否則,，不能繼續(xù)下一步操作,。 

 

③擴大培養(yǎng) 在無菌條件下，從檢測后的活化培養(yǎng)基上挑取10個左右菌落,，用接種針接種到擴大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中,，于37℃下振蕩培16-18h,，觀察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察,，根據(jù)結果來判斷能否進行下一步,。 

 

2.污染的檢測和判別 

 

①顯微鏡檢查 

 

⑴取樣：用無菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上; 

 

⑵制片、染色：自然風干后,用番紅染液染色1-2min,，水洗; 

 

⑶干燥后用油鏡下觀察,。 

 

②平板檢查

 

 ⑴配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌,，倒平板;

 

 ⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約10–6-10–7) 后涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上,，在37℃下培養(yǎng)24h;

 

 ⑶觀察菌落形態(tài)。 

 

③肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*) 將1ml待測液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中,，于37℃下培養(yǎng)24h,，觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色。

 

 三,、實驗結果 

 

1.種子的擴大培養(yǎng) 

 

觀察到在活化培養(yǎng)基上長出大量菌落,，且菌落顏色單一，均為淡黃色,。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量,，制作裝片，染色后在顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)多個視野中都為桿菌,，可初步得出活化的菌種中沒有污染雜菌。挑取沒有污染雜菌的菌落,，用無菌操作技術接種,，進行擴大培養(yǎng)。在適宜條件下培養(yǎng)18h后,，得到了大腸桿菌的種子液,，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。 

 

2.顯微鏡檢查 

 

鏡檢時,，多個視野中均觀察到的均為桿菌,，呈鏈狀或單個存在，沒有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細菌,，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染,。 

 

3.平板檢查 

 

從營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊,、表面光滑,、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落,，沒有觀察到其它形態(tài)的菌落,，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染。 

 

4.肉湯檢測培養(yǎng)基滅菌是否* 

 

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液,，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色,，堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測液若有菌體存在,，則菌體代謝會使培養(yǎng)基呈酸性,，顯示黃色。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后,，仍呈現(xiàn)紅色,，沒有變?yōu)辄S色，且澄清,，未渾濁,，說明待測液中沒有菌體存在，,，因此,，所測的滅菌種子培養(yǎng)基中沒有被菌體污染。 

 

四,、實驗討論 

 

1.在種子的擴大培養(yǎng)前要對菌種進行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子,，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴大培養(yǎng)時,，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌,，則應棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來活化和擴大培養(yǎng),。 

 

2.采用顯微鏡檢查法,，如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標菌株不同形態(tài)的菌體則可認為是污染了雜菌，該法簡便,、快速,，能及時檢查出雜菌。

 

但是也有其不足之處：

 

①對含雜菌少的樣品不易得出正確的結論,，故應多檢查幾個視野;

 

②由于菌體較小,，本身又處于非同步狀態(tài)，應注意不同生理狀態(tài)下目標菌與雜菌的區(qū)別,，必要時可用革蘭染色,、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。 

 

3.采用平板檢查法,，若出現(xiàn)與目標菌株形態(tài)不一的菌落,，就表明可能被雜菌污染;若要進一步確證，可配合顯微鏡形態(tài)觀察，若個體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標菌相異,，則可確認污染了雜菌,。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測，形象直觀,，肉眼可辨,，不需儀器。但需嚴格執(zhí)行無菌操作技術,，所需時間較長,，而且無法區(qū)分形態(tài)與目標菌相似的雜菌。在污染初期,，目標菌占絕大部分,，污染菌數(shù)量很少，所以要做比較多的平行試驗才能檢出污染菌,。 

 

4.肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來檢測培養(yǎng)基的滅菌是否*,，不適用于發(fā)酵液的檢查。 

 

5.可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來檢測是否有雜菌污染,。即在發(fā)酵過程中,，以發(fā)酵時間為橫坐標，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標,，作曲線,，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化，則很可能是污染了雜菌,。但是,，發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌。 

 

五,、結論 

 

了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害,，知道染菌不僅浪費大量原材料，造成嚴重的經(jīng)濟損失,，而且污染了環(huán)境,，所以，在種子活化培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)中每一步均需進行無雜菌檢查,。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來檢測雜菌污染,，方法較為簡便、形象直觀,，但是,，若要進行更準確的檢測，zuihao再做較多的平行實驗,。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*的有效方法,。