微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來(lái),，產(chǎn)率有了很大的提高,，然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們?cè)谂c雜菌污染的斗爭(zhēng)中,，積累總結(jié)出很多寶貴的經(jīng)驗(yàn),。規(guī)范了管理措施，設(shè)計(jì)了一系列設(shè)備(例如密閉式發(fā)酵罐,，培養(yǎng)基滅菌設(shè)備,，無(wú)菌空氣制備設(shè)備等)和管道，應(yīng)用了無(wú)菌室甚至無(wú)菌車間,，建立了無(wú)菌操作技術(shù),，因而大大降低了發(fā)酵染菌率。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅,，染菌后輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量,，重者造成“倒罐” ,，不但浪費(fèi)大量原材料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,，還會(huì)對(duì)周圍環(huán)境造成破壞,。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染，及早發(fā)現(xiàn)雜菌并采取相應(yīng)措施,，對(duì)減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要,。 

 

因此檢查的方法要求準(zhǔn)確、快速。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個(gè)時(shí)期,。種子培養(yǎng)期染菌的危害大,，因嚴(yán)格防止。一旦發(fā)現(xiàn)種子染菌,，均應(yīng)滅菌后棄去,，并對(duì)種子罐及其管道進(jìn)行*滅菌。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富,，容易染菌,，此時(shí)養(yǎng)分消耗不多，應(yīng)將發(fā)酵液補(bǔ)足必要養(yǎng)分后迅速滅菌,，并重新接種發(fā)酵,。發(fā)酵中期染菌不但嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌株的代謝，而且會(huì)影響產(chǎn)物的生成,，甚至使已形成的產(chǎn)物分解,。 

 

由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗，代謝產(chǎn)物的生成又不是很多,，挽救處理比較困難,，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發(fā)酵后期染菌,，此時(shí)產(chǎn)物積累已較多,，糖等養(yǎng)分已接近耗盡，若染菌不嚴(yán)重,，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵;若污染嚴(yán)重,，可提錢放罐。染菌程度越重,，危害越大;染菌少,，對(duì)發(fā)酵的影響就小。所以,，實(shí)際生產(chǎn)中,，應(yīng)當(dāng)根據(jù)污染程度和發(fā)酵時(shí)期區(qū)別對(duì)待。 

 

一,、實(shí)驗(yàn)器材與試劑 

 

1.器材 

 

高壓蒸汽滅菌鍋,、超凈工作臺(tái)、帶搖床的培養(yǎng)箱,、顯微鏡,、天平、三角瓶,、試管,、移液管、培養(yǎng)皿、 接種針,、平板涂布器,、酒精燈、載玻片 

 

2.試劑 

 

營(yíng)養(yǎng)瓊脂,、葡萄糖,、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂,、氯化鈉,、磷酸氫二鉀、牛肉gao,、蛋白胨,、0.4%酚紅溶液、蒸餾水,、番紅染液,、香柏油、擦鏡液 

 

3.培養(yǎng)基 

 

(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：直接稱量營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉4.5g,，溶于100mL蒸餾水配制,，pH 7.2，分裝到試管中,，滅菌后擺成斜面,。 

 

(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、磷酸二氫氨0.1%,、七水合硫酸鎂 0.02%,、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.1% 

 

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉gao0.3%,、蛋白胨0.8%,、葡萄糖 0.5%、氯化鈉0.5%,、0.4% 酚紅溶液,，pH 7.2 

 

二、實(shí)驗(yàn)方法 

 

1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 

 

①斜面培養(yǎng)基的配制 配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，分裝,，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面,。 

 

②菌種的活化 

 

⑴將大腸桿菌采用無(wú)菌操作的方法接種于斜面上，37℃下培養(yǎng)18h; ⑵培養(yǎng)18h后,，觀察菌落顏色是否一致,，若均為黃色，挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè);若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè),。檢測(cè)方法常用染色鏡檢,，若檢測(cè)后，沒(méi)有污染,，便可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);若檢測(cè)到雜菌,，要重復(fù)上述步驟，直到無(wú)菌為止,，否則,，不能繼續(xù)下一步操作。 

 

③擴(kuò)大培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下,，從檢測(cè)后的活化培養(yǎng)基上挑取10個(gè)左右菌落,，用接種針接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中，于37℃下振蕩培16-18h,，觀察菌落形態(tài),。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察，根據(jù)結(jié)果來(lái)判斷能否進(jìn)行下一步,。 

 

2.污染的檢測(cè)和判別 

 

①顯微鏡檢查 

 

⑴取樣：用無(wú)菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上; 

 

⑵制片,、染色：自然風(fēng)干后,用番紅染液染色1-2min，水洗; 

 

⑶干燥后用油鏡下觀察,。 

 

②平板檢查

 

 ⑴配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，滅菌，倒平板;

 

 ⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約10–6-10–7) 后涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,，在37℃下培養(yǎng)24h;

 

 ⑶觀察菌落形態(tài),。 

 

③肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否*) 將1ml待測(cè)液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24h,，觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色,。

 

 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 

 

1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 

 

觀察到在活化培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大量菌落,，且菌落顏色單一,，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量,，制作裝片,，染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)多個(gè)視野中都為桿菌,，可初步得出活化的菌種中沒(méi)有污染雜菌,。挑取沒(méi)有污染雜菌的菌落，用無(wú)菌操作技術(shù)接種,，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),。在適宜條件下培養(yǎng)18h后,，得到了大腸桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌,。 

 

2.顯微鏡檢查 

 

鏡檢時(shí),，多個(gè)視野中均觀察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個(gè)存在,，沒(méi)有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細(xì)菌,，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染。 

 

3.平板檢查 

 

從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形,、邊緣整齊、表面光滑,、半透明或乳白色,、菌落上有小的突起,，這是典型的大腸桿菌菌落,，沒(méi)有觀察到其它形態(tài)的菌落，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染,。 

 

4.肉湯檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否* 

 

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液,，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境中呈紅色,。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測(cè)液若有菌體存在,，則菌體代謝會(huì)使培養(yǎng)基呈酸性,，顯示黃色,。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后，仍呈現(xiàn)紅色,，沒(méi)有變?yōu)辄S色,，且澄清，未渾濁,，說(shuō)明待測(cè)液中沒(méi)有菌體存在,，，因此,，所測(cè)的滅菌種子培養(yǎng)基中沒(méi)有被菌體污染,。 

 

四、實(shí)驗(yàn)討論 

 

1.在種子的擴(kuò)大培養(yǎng)前要對(duì)菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子,，若菌種已活化則可省略這一步,。種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌,，則應(yīng)棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來(lái)活化和擴(kuò)大培養(yǎng),。 

 

2.采用顯微鏡檢查法,，如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標(biāo)菌株不同形態(tài)的菌體則可認(rèn)為是污染了雜菌,，該法簡(jiǎn)便,、快速，能及時(shí)檢查出雜菌,。

 

但是也有其不足之處：

 

①對(duì)含雜菌少的樣品不易得出正確的結(jié)論，故應(yīng)多檢查幾個(gè)視野;

 

②由于菌體較小,，本身又處于非同步狀態(tài)，應(yīng)注意不同生理狀態(tài)下目標(biāo)菌與雜菌的區(qū)別,，必要時(shí)可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對(duì)固形物多的發(fā)酵液檢查較困難,。 

 

3.采用平板檢查法，若出現(xiàn)與目標(biāo)菌株形態(tài)不一的菌落,，就表明可能被雜菌污染;若要進(jìn)一步確證,，可配合顯微鏡形態(tài)觀察，若個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標(biāo)菌相異,，則可確認(rèn)污染了雜菌,。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測(cè),，形象直觀,，肉眼可辨，不需儀器,。但需嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作技術(shù)，所需時(shí)間較長(zhǎng),，而且無(wú)法區(qū)分形態(tài)與目標(biāo)菌相似的雜菌,。在污染初期,，目標(biāo)菌占絕大部分，污染菌數(shù)量很少,，所以要做比較多的平行試驗(yàn)才能檢出污染菌,。 

 

4.肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)基的滅菌是否*，不適用于發(fā)酵液的檢查,。 

 

5.可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來(lái)檢測(cè)是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過(guò)程中,，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標(biāo),，作曲線，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化,，則很可能是污染了雜菌,。但是,，發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌。 

 

五,、結(jié)論 

 

了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害，知道染菌不僅浪費(fèi)大量原材料,，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,，而且污染了環(huán)境，所以,，在種子活化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中每一步均需進(jìn)行無(wú)雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來(lái)檢測(cè)雜菌污染,，方法較為簡(jiǎn)便、形象直觀,，但是,，若要進(jìn)行更準(zhǔn)確的檢測(cè)，zuihao再做較多的平行實(shí)驗(yàn),。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否*的有效方法。