柱壓升高
原因：緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出,，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙,，阻礙流動(dòng)相傳質(zhì)，引起柱壓升高,；
相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化
原因：如果沒有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣,，色譜柱內(nèi)含有的鹽會(huì)使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化；
柱效下降
原因：
i)有些緩沖鹽會(huì)滲入到鍵合相的深處,，損害硅膠基體,，導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失，柱床變松,，柱效下降;
ii)凝結(jié)在鍵合相表面,，使C18碳鏈難以舒展，對(duì)物質(zhì)的保留能力下降,，導(dǎo)致柱效下降,。因此用過(guò)緩沖鹽后需要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應(yīng)特別引起注意,。
流動(dòng)相中緩沖鹽的正確使用方法
1. 使用前的處理: 在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱,，直至基線平穩(wěn)。 原則上,，用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多),，不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽,。 理由：緩沖鹽通常易溶于水,，難溶于有機(jī)溶劑,。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對(duì)較小,，不先沖洗掉,，接下來(lái)做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機(jī)溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí),，緩沖鹽將會(huì)在色譜柱柱體上析出,，沉積下來(lái)，這將可能導(dǎo)致上述對(duì)色譜柱的損害,。
2. 使用后的處理：用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯*的區(qū)別是,，用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn),。如果該色譜柱在接下來(lái)很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不使用,，要長(zhǎng)期保存，則需再加上一步,，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍,，直至基線平穩(wěn)。
使用緩沖液要注意幾點(diǎn)：
1,、避免使用鹽酸鹽,，鹽酸鹽對(duì)鋼質(zhì)有腐蝕作用。
2,、緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用,，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有很多怪現(xiàn)象發(fā)生,。
3,、實(shí)驗(yàn)后不可用有機(jī)溶劑直接過(guò)度，有機(jī)溶劑會(huì)處使鹽類析出,，造成液路或色譜柱堵塞,，可用95：5的水甲醇沖洗。
4,、使用緩沖液要及時(shí)掌握ph范圍,，做到胸中有數(shù)。
5,、清洗液路和柱子時(shí),，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。
6,、長(zhǎng)時(shí)間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無(wú)析出,，若有白色鹽類析出,，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml,再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞,。
7,、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩,。
如果流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來(lái)沖洗緩沖鹽的,，是洗不出來(lái)的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗,，是可以把緩沖鹽沖洗出來(lái)的,，然后用純的有機(jī)溶劑來(lái)保護(hù)柱子。的方法是使用與流動(dòng)相相同濃度不含鹽的流動(dòng)相進(jìn)行清洗,。但就是速度慢一些,。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內(nèi),，且用0.8的流速較好. 如果用純水沖,，容易造成鍵合的碳鏈的流失,，用5%~10%甲醇水溶液沖。 可以用純水代替流動(dòng)相中的緩沖液,，有機(jī)相不變,。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。
色譜柱異常及解決辦法
柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無(wú)定形或球形硅膠),、顆粒大小,、填料合成條件、裝柱條件,、所用流動(dòng)相和分析時(shí)的溫度有關(guān),。不同廠家的色譜柱柱壓會(huì)有所差別，相同流動(dòng)相和溫度的條件下,，不同廠家的新色譜柱有的柱壓可能相差4,、5個(gè)MPa，特別是低端和色譜柱之間,，這一區(qū)別比較明顯,。這是由色譜柱廠家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的，這種差異的存在是正常的,。同時(shí)需要說(shuō)明的一點(diǎn)是,，柱壓與柱效有一定的關(guān)系，通常柱效高的色譜柱柱壓相對(duì)而言會(huì)高一點(diǎn),，但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效,。
在色譜柱的使用過(guò)程中柱壓通常會(huì)出現(xiàn)兩種升高的形式：
種是,，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)色譜柱柱壓慢慢上升，這是正常的,；
第二種是,，使用過(guò)程中(流動(dòng)相和溫度沒有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現(xiàn)象,，通常是由工作人員操作不當(dāng)引起的,。
原因：
1)樣品太臟,，使用前沒有過(guò)濾,，導(dǎo)致柱篩板堵塞；
2)樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好,，與流動(dòng)相混合后析出,，導(dǎo)致柱塞板堵塞；
3)使用緩沖鹽,，處理錯(cuò)誤,，緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙,。
解決辦法對(duì)于第二種,，即柱壓突然升高的情況，通常有以下幾種解決辦法：
1)將色譜柱反接,，用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗,。
2)色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下，分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板,。如果柱效沒變，但柱壓仍然較高,，則應(yīng)考慮進(jìn)樣端填料受污染的問(wèn)題,，因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外，還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料,，挖去填料之前先檢查一下填料的顏色，如果填料的顏色發(fā)生了變化,，則應(yīng)該挖掉直到見到白色的填料為止,。
挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個(gè)缺口，填補(bǔ)缺口的填料可以從另一支相同品牌,、相同型號(hào)的報(bào)廢色譜柱的出口端獲得,，填料用有機(jī)溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處，壓緊刮平,，再裝上篩板,。
柱子使用經(jīng)驗(yàn)談
色譜柱在使用前,，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái),，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考,。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相,、柱溫等條件的差異而有所不同,；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是*條件),，只有這樣,，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1,、樣品的前處理：
a,、使用流動(dòng)相溶解樣品。
b,、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì),。
c、使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì),。
2,、流動(dòng)相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a,、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b,、流動(dòng)相具有一定惰性,，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
c,、流動(dòng)相的黏度要盡量小,，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降,，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度),。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng),。如使用UV檢測(cè)器,，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e,、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行,。
f,、在流動(dòng)相配制好后,，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。
3、流動(dòng)相流速的選擇：
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求*柱效,，使用*流速,。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min,，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml/min為佳,。 當(dāng)選用*流速時(shí),，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a.由于甲醇廉價(jià),，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外),。
b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用,。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐),，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果,。
c.含水流動(dòng)相*在實(shí)驗(yàn)前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入疊dan化na,，防止細(xì)菌生長(zhǎng),。
d.流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì),。
e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相,，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能,。
沖柱子的目的
只要是有機(jī)溶劑就行,，不過(guò)黏度不要太大，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能夠防止細(xì)菌生長(zhǎng),，沖柱子的目的就是為了防止細(xì)菌生長(zhǎng)堵塞儀器系統(tǒng)和柱子,。 一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒有問(wèn)題的,，但乙腈要比甲醇價(jià)格貴的 。
保留時(shí)間變化的原因:
柱頭塌陷
在使用過(guò)程中,，填料下沉,，在柱子進(jìn)口處出現(xiàn)一個(gè)小空間，使得分離效果不良,。
補(bǔ)救方法：卸開柱頭螺絲,，找一點(diǎn)同類填料，用甲醇濕潤(rùn)后,，添在柱子上,，反復(fù)幾次。然后裝上螺絲,，用溶劑沖洗1-2小時(shí),，使之平衡。
小結(jié)
正確使用緩沖鹽很有必要,，既可以防止緩沖鹽析出,，也可以達(dá)到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來(lái)總結(jié)它的使用方法：用前要過(guò)濾,，用后需沖洗,。
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