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采用荷蘭Chemtrix微通道反應(yīng)器快速按需合成抗癌藥物洛莫司汀
【普渡大學(xué)2019 OPRD案例】采用荷蘭Chemtrix微通道反應(yīng)器快速按需合成抗癌藥物洛莫司汀
【背景介紹】
洛莫司?。↙omustine）,，是一類被廣泛使用的高親脂性烷基化抗癌藥物，通過在體內(nèi)產(chǎn)生氯乙基碳離子和碳?；虚g體,，這些親電化合物攻擊DNA上的親核部位，形成烷基化產(chǎn)物,，從而發(fā)揮藥效作用的。其他類別的抗癌藥物,，比如鏈霉素,、博來霉素和蒽環(huán)類，需要生物激活作用（bioactivation）來與細(xì)胞靶點(diǎn)反應(yīng),，而洛莫司汀不需要預(yù)激活,。不同于作用于鳥嘌呤的N7烷基化試劑，洛莫司汀則在O6形成氯乙基化加合物,，進(jìn)而導(dǎo)致鏈間DNA的交聯(lián),。如果DNA不進(jìn)行修復(fù)，這種交聯(lián)會(huì)在DNA復(fù)制過程中導(dǎo)致雙鏈斷裂,，終細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡,。洛莫司汀作為一種可口服抗腫瘤藥，每6周服用一次,。它早是在20世紀(jì)60年代后期進(jìn)行的臨床試驗(yàn)評估,，并于1976年獲得FDA的批準(zhǔn)，用于治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤以及霍奇金淋巴瘤。百時(shí)美施貴寶初以CeeNu品牌持有該藥物的zhuanli,。2014年,，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Next Source Biotechnology公司被以Gleostine的商標(biāo)對洛莫司汀進(jìn)行重新包裝。近,，Gleostine的平均批發(fā)價(jià)格出現(xiàn)了大幅上漲,，其原因是處理致癌化合物所產(chǎn)生的監(jiān)管風(fēng)險(xiǎn) 。因此,，這促使我們努力開發(fā)一種通過連續(xù)流動(dòng)技術(shù)合成洛莫司汀的方法,。
流動(dòng)化學(xué)技術(shù)近在工業(yè)界和學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室中都進(jìn)行了廣泛的探索，被證實(shí)是一種有效的合成技術(shù),。與傳統(tǒng)的釜式合成工藝相比,，由于連續(xù)流技術(shù)可以快速混合和控制反應(yīng)參數(shù)，進(jìn)而更好地控制反應(yīng)條件和選擇性,，如溫度,、化學(xué)計(jì)量、壓力和保留時(shí)間,。強(qiáng)化的傳熱和傳質(zhì)能力也提供了更安全的操作條件,。連續(xù)流合成的工藝強(qiáng)化可以有助于提高化學(xué)反應(yīng)效率，縮短反應(yīng)時(shí)間,，減小反應(yīng)規(guī)模,，提高產(chǎn)品的質(zhì)量和一致性。因此,，原料藥的連續(xù)流合成技術(shù)在近幾年變得吸引力,。然而，由于工作條件,、溶劑切換和流速差異等因素的限制,，通過連續(xù)流技術(shù)有效地執(zhí)行多步反應(yīng)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外,，連續(xù)流方法的反應(yīng)條件的優(yōu)化和分析技術(shù)仍需要大量人力物力的投入,。
【連續(xù)流方法】
Purdue大學(xué)的David H. Thompson課題組近日報(bào)道了洛莫司汀通過連續(xù)流合成的新工藝方法，并使用解吸電噴霧電離質(zhì)譜（DESI-MS）對其進(jìn)行分析檢測指導(dǎo)工藝的優(yōu)化方案,。終工藝路線是兩個(gè)反應(yīng)串聯(lián)在一起,，不分離中間體，具備反應(yīng)器裝置簡易,、原料廉價(jià)等特點(diǎn)因此可以降低生產(chǎn)成本（反應(yīng)流程如圖1所示）,。相關(guān)結(jié)果發(fā)表在Org. Process Res. Dev.2019，23,，3,，334-341（DOI：10.1021/acs.oprd.8b00387）雜志上,。
圖1 使用連續(xù)流技術(shù)兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的工藝路線，其中4 = NaNO2/HCO2H ,，5 = tBuONO
洛莫司汀合成的步在室溫下是快反應(yīng),。在連續(xù)流中對該反應(yīng)的溫度、溶劑和投料比進(jìn)行優(yōu)化,，進(jìn)而確定獲得大產(chǎn)品收率的條件,。檢測反應(yīng)使用TLC和MS，其中MS使用正離子模式下三重四極質(zhì)譜儀,，以快速探測出每種反應(yīng)條件下的全質(zhì)譜和產(chǎn)物離子分布,。
為了揭示步的佳條件，作者設(shè)計(jì)了一種級聯(lián)方法,。運(yùn)用荷蘭Chemtrix微通道反應(yīng)器,，選用 3225 SOR靜態(tài)混合區(qū)芯片，泵送環(huán)己胺（1）,，1-氯-2-異氰酸乙酯-乙烷（2）和三乙胺（TEA）溶液,，自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)收集小瓶中的產(chǎn)品（如圖2所示）。蒸發(fā)反應(yīng)混合物,，用冷Et2O洗滌白色固體并真空干燥,，然后用TLC、MS,、MS/MS和NMR（1H和13C）分析,。
圖2 合成中間體 3的Chemtrix微反應(yīng)器 glass reactor chip (SOR 3225). A = 1 in THF; B = 2 in THF, C = TEA in THF.
作者對該步反應(yīng)使用的保留時(shí)間（τ）、反應(yīng)溫度（T）,、1-氯-2-異氰酸乙酯/環(huán)己胺比等條件進(jìn)行探討,。如圖3所示，在較長的保留時(shí)間下,，EtOH為溶劑的產(chǎn)品產(chǎn)量急劇下降（Entry1-3）,，原因是因?yàn)?-氯-2-異氰酸乙酯會(huì)被溶劑醇解，盡管3在ACN中的收率很高,，但它在該溶劑中的溶解度很低，導(dǎo)致嚴(yán)重堵塞,。對于甲苯和Et2O,，即使在低濃度下也發(fā)現(xiàn)了類似的堵塞問題（Entry7-8）。而在溶劑THF中,，產(chǎn)率在在50 oC下30 s達(dá)到大值（Entry9-14）,，并且由于高溫會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物分解，溫度升高,，產(chǎn)率會(huì)下降（Entry13-14）,。提高2的當(dāng)量可以提高產(chǎn)率（Entry15-21）,，而延長保留時(shí)間，也可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品分解(Entry21),。終,，作者確立了佳的反應(yīng)條件：τ = 60 s, T = 50 °C, 1.4 當(dāng)量的1-氯-2-異氰酸乙酯。在該條件下,，反應(yīng)的高產(chǎn)率可達(dá)到92%（Entry 20）,。
圖3 合成中間體3的反應(yīng)條件篩選
對于第二步的合成，作者使用DESI-MS來評估溶劑,、濃度和硝化試劑類型對洛莫司汀產(chǎn)率的影響,。DESI-MS初應(yīng)用于完整樣本的表面分析，如癌癥診斷用生物組織或藥物檢測指紋圖譜,。在近,，DESI-MS方法已用于化學(xué)反應(yīng)分析。該方法主要目的是在受限的體積內(nèi)產(chǎn)生反應(yīng)加速現(xiàn)象,，比如在MS噴霧電離過程的微液滴中,，通過這種技術(shù)可以達(dá)到5ms的分析速度，每小時(shí)接近一萬個(gè)反應(yīng)點(diǎn),。
作者使用了這項(xiàng)技術(shù)來研究兩種亞硝化方法,，首先，評價(jià)了亞硝酸鈉,、甲酸作為亞硝化試劑對中間體3向洛莫司汀轉(zhuǎn)化的效率,。然后將該轉(zhuǎn)化率與亞硝酸叔丁酯（TBN，5）作為亞硝化試劑進(jìn)行比較,。用DESI-MS研究了NaNO2/HCO2H體系不同反濃度和溶劑條件下的轉(zhuǎn)化效果,。在探究中，洛莫司汀的分子離子峰m/z= 234未被觀察到,。對市售洛莫司汀樣品的分析兩者產(chǎn)生了非常相似的質(zhì)譜,，這表明電離過程中該分子很容易發(fā)生碎裂。通過三重四極質(zhì)譜與電噴霧電離,，以及離子阱質(zhì)譜聯(lián)用DESI,，質(zhì)譜中得到了一個(gè)穩(wěn)定的固體碎片離子在m/z 169。該反應(yīng)產(chǎn)生的洛莫司汀碎片與市售的洛莫司汀相匹配這一事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn),。THF/H2O中所有NaNO2濃度的反應(yīng)比ACN/H2O的反應(yīng)效果更好（圖4a）,。此外，與THF/H2O反應(yīng)相比,，來自3的碎片在ACN/H2O反應(yīng)中為豐富,，表明起始物質(zhì)在ACN/H2O中的轉(zhuǎn)化相對緩慢。接下來,，將8種不同溶劑（EtOH,、MeOH,、DCM、ACN,、甲苯,、DMSO、THF和EtOAC）進(jìn)行結(jié)果比較優(yōu)化連續(xù)流合成,。所有八種溶劑都使用4作為亞硝化試劑并得到了類似的結(jié)果（圖4b）,。當(dāng)使用5作為硝化試劑時(shí)，在除THF和EtOAc以外的所有溶劑中都檢測到洛莫司?。▓D4c）,。
圖4 DESI-MS 樣品盤顯示了在合成洛莫司汀的條件篩選中是否存尋找的離子峰，藍(lán)色點(diǎn)表示m/z169出現(xiàn)了（成功反應(yīng)）,，紅色點(diǎn)則表示沒有出現(xiàn)（不成功反應(yīng)） (A) NaNO2作為硝化試劑時(shí)的濃度篩選. (B) NaNO2作為硝化試劑時(shí)的溶劑篩選(C) tBuONO 作為硝化試劑時(shí)的溶劑篩選
接下來,，作者利用DESI-MS高通量實(shí)驗(yàn)中得到的反應(yīng)條件來優(yōu)化連續(xù)流合成，并檢查由DESI-MS確定的不成功反應(yīng)在流量條件下是否會(huì)產(chǎn)生負(fù)遷移,。從DESI-MS實(shí)驗(yàn)中可知,，THF是使用4進(jìn)行亞硝化反應(yīng)的佳溶劑。由于亞硝化試劑是吸濕的并且容易氧化成硝酸鹽,，反應(yīng)常常會(huì)使用過量的4,，進(jìn)而將3大限度地轉(zhuǎn)化為洛莫司汀?？偟膩碚f,，DESI-MS實(shí)驗(yàn)在投料比、試劑和溶劑方面與流動(dòng)反應(yīng)條件的結(jié)果非常一致,。在連續(xù)流反應(yīng)中篩選洛莫司汀的轉(zhuǎn)化率（圖5）,。作者使用TLC和MS檢測反應(yīng)。初,，在0°C,、保留時(shí)間為30s的條件下。令人欣慰的是,，在這么短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)獲得了洛莫司汀,，雖然轉(zhuǎn)化率很低（圖6，Entry1）,。適當(dāng)提高保留時(shí)間可以提高轉(zhuǎn)化,；然而，較長的保留時(shí)間似乎增加了對洛莫司汀的分解(Entry2-6),。同時(shí),，作者將溫度保持在0°C,，以避免NaNO2分解成高溫下產(chǎn)生的重氮鹽,。
圖5 合成洛莫司汀的微反應(yīng)器,，在 Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用NaNO2 /HCOOH（4）作為硝化試劑，A = 3 in THF; B = HCO2H , C = NaNO2 in MeOH/H2O (4:1).
接下來,，作者對洛莫司汀的不同分離chun化方法進(jìn)行了評價(jià),。首先，用Et2O（3次）萃取產(chǎn)物,，以利用3在該溶劑中的低溶解度（Method 1）,。不幸的是，薄層色譜分析顯示有機(jī)層和水層中都存在3,。只好將有機(jī)萃取物經(jīng)無水Na2SO4干燥并在真空中濃縮以產(chǎn)生黃色油,，該油在Et2O中重新溶解，在冰浴中冷卻以從混合物中沉淀3,。對濾液的NMR分析顯示,，仍有22%的3殘留在分離的洛莫司汀產(chǎn)品中。接下來,，作者換用ACN（Method2）重結(jié)晶來純化產(chǎn)物,。雖然得到了非常純的洛莫司汀，但使用這種方法的回收率很低,。后,，作者發(fā)現(xiàn)使用石油醚熱過濾可去除不溶性雜質(zhì)3（Method3）。干燥后濾液濃縮得到純的洛莫司汀,，通過NMR分析檢測不到3,。采用此方法，在0°C,，保留時(shí)間為5分鐘,，3當(dāng)量4的反應(yīng)條件下，以74%的分離收率得到純的洛莫司汀,。
圖6 使用4作為硝化試劑時(shí),，不同反應(yīng)條件下洛莫司汀的分離收率
當(dāng)使用5作為亞硝化劑時(shí)，作者也在保留時(shí)間,、溫度和溶劑方面對反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化（反應(yīng)裝置如圖7所示）,。結(jié)果表明，在保留時(shí)間（8分鐘）,、降低溫度（25°C）和增加5的比率（3當(dāng)量）的條件下,，通過方法3chun化后，洛莫司汀有了進(jìn)一步的提高（91%分離收率）,。
圖7 合成洛莫司汀的微反應(yīng)器,，在 荷蘭Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用tBuONO（5）作為硝化試劑，A = 3 in ACN/ EtOH (3.7:1); B = 5 in ACN.
下一步研究了連續(xù)流裝置下的兩步串聯(lián)反應(yīng),，作者使用荷蘭Chemtrix反應(yīng)器來觀察碳?；蛠喯趸磻?yīng),。然而，在兩個(gè)步驟之間需要萃取,，以去除反應(yīng)中存在的三乙胺,，避免在第二步驟中競爭性地消耗亞硝化試劑。作者通過在亞硝化步驟之前使用市售Zaiput液-液萃取器去除堿,，并通過使用FEP管式反應(yīng)器重新優(yōu)化合成來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)（圖8）,。開始時(shí)，佳反應(yīng)條件為：步在50°C下,，保留時(shí)間1分鐘,，第二步在0°C下，保留時(shí)間5分鐘,，得到43 mg（總收率51.8%）的chun洛莫司?。▓D9，Entry 1）,。在使用4作為亞硝化試劑的條件下,，通過改變步或第二步的保留時(shí)間來提高FEP管式反應(yīng)器中洛莫司汀產(chǎn)率是不能成功的（Entry 1-4）。
圖8 利用4做為硝化試劑,，兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的實(shí)驗(yàn)裝置
而在隨后的實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明,，5比4是一種更好的合成洛莫司汀的亞硝化試劑。終的優(yōu)化條件包括步在50℃下的1分鐘反應(yīng)時(shí)間和第二步在25℃下的8分鐘反應(yīng)時(shí)間（如圖10所示）,。由于從步提取的少量三乙胺對TBN活性產(chǎn)生了影響,，降低所用三乙胺的量使得洛莫司汀產(chǎn)量增加（表4，Entry 7-9）,，通過該反應(yīng)裝置制得110 mg的洛莫司?。ū?，條目9）,，總收率為63%,。通過這種串聯(lián)反應(yīng)路線制得的洛莫司汀的經(jīng)TLC、NMR（1H和13C）,、MS和MS/MS表征與市售的洛莫司汀樣品的測定值相同,。
圖9 串聯(lián)反應(yīng)合成洛莫司汀的條件篩選
采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）對合成的洛莫司汀進(jìn)行chun度鑒定，并將該物質(zhì)的總離子色譜（TIC）值與市售的洛莫司汀標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較,。TIC與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品*重疊,，沒有出現(xiàn)任何新的副產(chǎn)品。
圖10 利用5做為硝化試劑,，兩步串聯(lián)法合成洛莫司汀的實(shí)驗(yàn)裝置
【實(shí)驗(yàn)結(jié)論】
1.作者利用DESI-MS開發(fā)了一種快速連續(xù)合成洛莫司汀的方法,，指導(dǎo)了二步整體轉(zhuǎn)化中第二步反應(yīng)條件的優(yōu)化。
2.該工藝采用9分鐘的總保留時(shí)間，以63%的總分離收率生產(chǎn)chun品洛莫司汀,，與釜式反應(yīng)相比,，無論從收率和效率方面都有了很大的提高。
3.亞硝酸叔丁酯（5）是一種溫和而的亞硝化試劑,，并且可以通過簡單的提取、過濾和洗滌來分離chun洛莫司汀,。這是一個(gè)更快更綠色的合成工藝,，該工藝可以顯著縮短反應(yīng)時(shí)間，減少廢物產(chǎn)生,，避免任何色譜分離步驟,。使用這種方法，每小時(shí)可以產(chǎn)生110 mg的洛莫司汀,。同時(shí)作者也在對洛莫司汀放大生產(chǎn)和在線再結(jié)晶進(jìn)行探討,。
Reference
Org. Process Res. Dev.2019，23,，3,，334-341
公司簡介：
深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應(yīng)器）,、英國AM公司（連續(xù)多級攪拌反應(yīng)器,、催化加氫系統(tǒng)）、英國NiTech公司（連續(xù)結(jié)晶儀,、連續(xù)合成儀）在中國區(qū)的代理商和技術(shù)服務(wù)商,，為廣大高校和企業(yè)提供連續(xù)合成、在線萃取,、連續(xù)結(jié)晶,、在線過濾干燥、在線分析等整套連續(xù)工藝解決方案,。
公司與復(fù)旦大學(xué),、南京大學(xué)、中山大學(xué),、華東理工大學(xué),、南京工業(yè)大學(xué)、浙江工業(yè)大學(xué),、河北工業(yè)大學(xué)等高校研究機(jī)構(gòu)合作成立微通道連續(xù)流化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,，致力于推動(dòng)連續(xù)流工藝在有機(jī)合成、精細(xì)化工,、制藥行業(yè),、能源材料、食品飲料等領(lǐng)域的應(yīng)用，合作實(shí)驗(yàn)室可以為客戶的傳統(tǒng)間歇釜式工藝在連續(xù)流工藝上的轉(zhuǎn)變提供工藝驗(yàn)證,、連續(xù)流工藝開發(fā)工作,，促進(jìn)制藥及精細(xì)化工企業(yè)由傳統(tǒng)間歇工藝向綠色、安全,、快速,、經(jīng)濟(jì)的連續(xù)工藝轉(zhuǎn)變。
公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺(tái)州,、江蘇南京合作組建了連續(xù)流微通道工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)中心（以下簡稱“工業(yè)化技術(shù)中心”）,，旨在打造集連續(xù)流微通道工藝開發(fā)、中試試驗(yàn),、工業(yè)化驗(yàn)證,、技術(shù)交流于一體的綜合性連續(xù)流微通道應(yīng)用技術(shù)服務(wù)中心，以為廣大生物醫(yī)藥企業(yè),、化工類企業(yè)提供專業(yè),、完善的智能化連續(xù)流工藝整套系統(tǒng)解決方案及技術(shù)服務(wù)方案。