TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope),，全內反射熒光顯微鏡,，利用光從高折射率的介質進入較低折射率的介質時，如果入射角足夠大時則光全部被反射而不發(fā)生折射,，但是在兩種介質的界面會產生衰逝波可以激發(fā)近界面100nm范圍內的熒光的原理來實現(xiàn)對物體表面的觀察,。可通過常規(guī)熒光顯微鏡的照明器或特殊照明器送入激發(fā)光,，并對激光的入射角度進行控制,，采用瞬間場激發(fā)方法以避免激發(fā)光進入探測器，在玻璃和水界面的激發(fā)光產生全內反射實現(xiàn)的,。因為激發(fā)光呈指數衰減的特性,，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會產生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測標的,，故此項技術廣泛應用于細胞表面物質的動態(tài)觀察,。
全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM)示意圖
?、贅悠?nbsp;②損耗波范圍 ③蓋玻片 ④浸鏡油 ⑤目標 ⑥發(fā)射光束(信號) ⑦激發(fā)光束
為了實現(xiàn)全內反射，需要大的入射角,，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度,。這可以通過棱鏡(prism)實現(xiàn)，稱為棱鏡型TIRFM(prism-based TIRFM),，也可通過高數值孔徑的物鏡實現(xiàn),，此時稱為物鏡型TIRFM(objective-type TIRFM)。現(xiàn)在商品化的全內反射熒光顯微鏡一般都是物鏡類型的,，速度快,，精度高。
全內反射熒光顯微鏡由于能實現(xiàn)物體表面非常薄范圍內(小于100nm)熒光觀察,，故在某些生物領域得到廣泛應用,。如以下等應用：
細胞表面圖象的觀察：細胞膜表面結構、細胞表層的接觸,、膜表面動力學/蛋白質定位,。
單分子觀察及其操作：肌球蛋白、肌動蛋白與Cy3標記ATP,。
細胞膜表面運動：如泡吞,、泡吐現(xiàn)象，泡外分泌現(xiàn)象,。
細胞膜鈣火花現(xiàn)象的觀察,，離子通道監(jiān)視。
分子馬達研究：旋轉的馬達,、細胞骨架蛋白,、聚合體、G蛋白,、環(huán)狀蛋白,、核苷酸馬達。
除了在生物領域外,，在化學領域等對于化學分子結構觀察中也有很好的應用,。
