詳細介紹
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù),,現(xiàn)已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病,、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,,根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,,認為ELISA法具有靈敏、特異,、簡單,、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點,。不僅適用于臨床標本的檢查,,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調(diào)查,。本法不僅可以用來測定抗體,,而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原,,所以也是一種早期診斷的良好方法,。
大鼠ELISA試劑盒組成及試劑配制
1、酶聯(lián)板(Assayplate):一塊(96孔),。
2,、標準品(Standard):2瓶(凍干品)。
3,、樣品稀釋液(SampleDiluent):1×20ml/瓶,。
4、生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibodyDiluent):1×10ml/瓶,。
5,、辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidinDiluent):1×10ml/瓶。
6,、生物素標記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
7,、辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
8、底物溶液(TMBSubstrate):1×10ml/瓶,。
9,、濃洗滌液(WashBuffer):1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10,、終止液(StopSolution):1×10ml/瓶(2NH2SO4)
大鼠ELISA試劑盒操作步驟:
1、標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔,,在*,、第二孔中分別加標準品100μl,然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl,,混勻;然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,,混勻,;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五,、第六孔中,,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻,;混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,,再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為1800ng/L,,1200ng/L,,600ng/L,300ng/L,,150ng/L),。
2、加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,,其余各步操作相同),、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍),。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,。
3、溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
4,、配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。
5,、洗滌:小心揭掉封板膜,,棄去液體,甩干,,每孔加滿洗滌液,,靜置30秒后棄去,如此重復5次,,拍干,。
6,、加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外,。
7,、溫育:操作同3。
8,、洗滌:操作同5,。
9、顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,,37℃避光顯色15分鐘,。
10、終止:每孔加終止液50μl,,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),。
11、測定:以空白空調(diào)零,,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。