1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:適用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份,。用無菌管收集細(xì)胞上清液,以1000×g離心15分鐘,,收集上清,。 2. 細(xì)胞:用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次,調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104 -106/ml 左右,,通過反復(fù)凍融,,使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,或者細(xì)胞超聲粉碎,,離心取上清液檢測,。 3. 血清:在室溫下,血液自然凝固,以1000×g離心15分鐘,,取上清待測,。 4. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合后靜置10-20 分鐘后,,以1000×g離心15分鐘,,收集上 清。 5. 體液:包括胸腹水,、腦脊液,,分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集,,以1000×g離心15分鐘,,收集上清。 6. 組織標(biāo)本:切取組織標(biāo)本,,稱取重量0.5mg,,加入500ul 的PBS,用手工或勻漿器,,或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿,,以2000-3000 rmp離心20 分鐘,收集上清進(jìn)行檢測,。 7. 樣品中不能含有NaN3,,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。 8. 保存:如果樣品不能立即檢測,,應(yīng)將其分裝,,-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍,。保存過程中如出現(xiàn)沉淀,,應(yīng)再次離心。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中含大量顆粒,,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 | 1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋,。 2.加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同),、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,,然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍),。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,。 3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。 5.洗滌:小心揭掉封板膜,,棄去液體,甩干,,每孔加滿洗滌液,,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,,拍干,。 6.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外,。 7.溫育:操作同3,。 8.洗滌:操作同5。 9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘,。 10. 終止:每孔加終止液50μl,,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。 11. 測定:以空白空調(diào)零,,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 |