RNAfixer 無(wú)液氮 RNA 樣品儲(chǔ)存液公司正在出售的產(chǎn)品：鴨胚肝間質(zhì)細(xì)胞（永生化）　G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體p2y12封閉多肽　滅鮭氣單胞菌PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠膠原酶I(Collagenase I)ELISA檢測(cè)試劑盒　6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）酶活性比色法檢測(cè)試劑盒　?，F(xiàn)青霉　卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白25抗體

商品屬性：

保存條件：

室溫(18-25℃)保存1 年以上,，如果使用時(shí)發(fā)現(xiàn)有沉淀或者析出,，可以37℃水浴加熱重新溶解后使用,，重新溶解后不會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量,。
產(chǎn)品介紹：
RNAfixer 是一種液態(tài)的無(wú)毒的組織保存液體,，可以迅速滲入新鮮組織細(xì)胞的胞漿中,，在非凍狀態(tài)下原位穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的RNA,。取下組織薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影響將來(lái)提取RNA 的質(zhì)量和數(shù)量。RNAfixer 消除了RNA 樣品需要立刻處理或者必須液氮保存的不方便,。浸入RNAfixer 后,，新鮮組織細(xì)胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周,，4℃下保存一個(gè)月,，在-20℃或-80℃下長(zhǎng)期保存。
RNA 病毒樣品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一個(gè)月。適用于動(dòng)物組織（心,、肝,、腎、肌肉,、睪丸,、腦、脾等）,、培養(yǎng)細(xì)胞,、RNA 病毒、 果蠅,、細(xì)菌,、白細(xì)胞、一些植物組織等,。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.操作容易：將組織成適當(dāng)大小,，浸沒(méi)在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.無(wú)需液氮：使樣品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規(guī)模采集,。
3.方便運(yùn)輸：處理過(guò)的樣品能在25℃保存一周,使樣品郵寄和運(yùn)輸變得容易和便宜,有利學(xué)術(shù)合作和交流,。
4.多次凍融: 經(jīng)RNAfixer 處理的樣品可反復(fù)凍融多次, 其間可對(duì)樣品進(jìn)行各種處理而不影響最終提取的RNA 的質(zhì)量。
5.可比性強(qiáng): RNAfixer 能減少大規(guī)模樣品處理中的誤差,增加各次實(shí)驗(yàn)數(shù)間的可比性, 對(duì)大規(guī)?；虮磉_(dá)譜的分析尤其有用,。
使用說(shuō)明：
RNAfixer 只用于新鮮組織，浸泡入 RNAfixer 前禁止冷凍組織,。只需要迅速將新鮮組織成長(zhǎng),、寬，高任意一邊厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可（只要有一邊厚度不超過(guò) 0.5 厘米,，RNAfixer 可以迅速滲透,，其它兩邊的尺寸并不重要）。將新鮮組織浸泡 在 5 倍體積的 RNAfixer 中,，按照指示存放在適當(dāng)?shù)臏囟取?/span>
1.動(dòng)物組織 RNAfixer 并不破壞或者溶解組織結(jié)構(gòu),，因此浸泡在 RNAfixer 中達(dá)到滲透平衡的組織 可以從 RNAfixer 中取出，然后切成更小的塊,，然后放回到 RNAfixer 中下次繼續(xù)使用,。小器官如小鼠肝、腎,、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推薦不同組織樣品的 RNAstore 使用量：

 2.植物組織很多植物組織直接浸泡入 RNAfixer 即可,，有的植物有天然滲透屏障如臘質(zhì)保護(hù)層,，需要先破壞掉臘質(zhì)層,便于 RNAfixer 滲透。
3.組織培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞吹打下來(lái)后,離心收集細(xì)胞,棄上清，用冰浴的 PBS 緩沖液洗一次去除殘留培養(yǎng)液,。將細(xì)胞懸浮在少量 PBS 緩沖液中,。加入五到十倍體積 RNAfixer, 混均。
4.白細(xì)胞對(duì)于全血中白細(xì)胞的保存,，需將白細(xì)胞從紅細(xì)胞和血清中分離出來(lái),，并按組織培養(yǎng)細(xì)胞一樣處理后，白細(xì)胞便能有效地保存在 RNAfixer 中,。不要將全血,、血漿或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中，因?yàn)樗鼈兊鞍缀窟^(guò)高,，與 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀,。
5.細(xì)菌
細(xì)菌并不能在 RNAfixer 中生長(zhǎng)，但是 RNAfixer 并不破壞細(xì)菌,，E. coli 在 4℃保存一個(gè)月仍舊可以提出完整的 RNA,。
RNAfixer 中樣本的存放：
1.存放在-80℃樣品長(zhǎng)期保存用。將 RNA fixer 中樣本放置于 4℃過(guò)夜,，然后將樣本撈出,，盡量去除干凈 RNAfixer 液體，然后放置于-80℃,。對(duì)于組織培養(yǎng)細(xì)胞,，則不需要去除RNAfixer，直接冷凍于-80℃,，并不會(huì)裂解細(xì)胞,。樣品使用時(shí)可以在室溫融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產(chǎn)量,。
2.存放在-20℃將 RNAfixer 中樣本放置于 4℃過(guò)夜,，然后轉(zhuǎn)移到-20℃。在-20℃樣品并不會(huì)被冰凍,但是可能會(huì)形成一些結(jié)晶,，這并不會(huì)影響將來(lái)的 RNA 提取,。樣品使用時(shí)可以在室溫 融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產(chǎn)量,。
3.存放在 4℃樣本可以在 4℃存放一個(gè)月,。
4.存放于 25℃存放于 25℃樣本的 RNA 在一周內(nèi)保持完整，保存兩周的樣品 RNA 有輕微降解,，勉強(qiáng)能用于northern analysis, 但是質(zhì)量足夠用于nuclease protection assay or RT-PCR ,。
5.存放于 37℃存放于 37℃樣本的 RNA 在 24 小時(shí)內(nèi)保持完整，3 天的時(shí)候有部分降解,。RNAfixer 保存樣本的 RNA 提?。?/span>將樣本從 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池,，用自來(lái)水沖即可，不需特殊處理,。
1.組織
用干凈鑷子將樣本從 RNAfixer 中撈出,，用吸水紙稍稍吸去殘留的 RNAfixer 后，可以和新鮮組織一樣按照液氮研磨,，然后勻漿處理的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行提取 RNA,。
2.細(xì)胞
對(duì)于儲(chǔ)存在 RNAfixer 中的細(xì)胞有兩種選擇。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一個(gè)是直接從細(xì)胞和 RNAfixer 的混合物提取,。
1）去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的細(xì)胞變得不那么脆弱,，可以承受較高的離心速度而不被裂解。 我們有在 5000g 離心成功收集細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn),，由于每種細(xì)胞的強(qiáng)度不一樣,，可以先用不重要的細(xì)胞做個(gè)預(yù)試驗(yàn)，以保證在使用的速度下離心不會(huì)破壞細(xì)胞,。另一個(gè)選擇是在離心前加等體積的 PBS 稀釋 RNAfixer 和細(xì)胞的混合物,，以減少溶液的密度，使細(xì)胞溶液可以沉淀下來(lái),。
2）不去除 RNAfixer,，直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍體積的一步法提取試劑（如 TRIpure，TRI reagent）到細(xì)胞和RNAfixer 的混合物,，然后按照正常步驟操作,。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一,、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板,、引物,、DNA聚合酶、DNA解旋酶,、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板,、引物,、PCR Buffer、Taq酶,、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增,；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸,，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,，達(dá)到較高水平,。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng),， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,，cDNA等,，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板,，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量,。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板,，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈,。從第二輪開(kāi)始,，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō),，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響,，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增,。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋,。

公司正在出售的產(chǎn)品：

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增),。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1,、擴(kuò)增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3,、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng),。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5,、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋,。