無內(nèi)毒素高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：豬骨骼肌衛(wèi)星細胞(永生化)　鋅指蛋白265封閉多肽　非洲豬瘟病毒PCR檢測試劑盒　大鼠結(jié)締組織生長因子(CTGF)ELISA檢測試劑盒　BCA蛋白法含量酶活性比色法檢測試劑盒　亞灰樹花(大奇果菌)　核因子1C型抗體

商品屬性：

保存條件：本產(chǎn)品收到后按照上面指示溫度存放各成份,，儲存18個月不影響使用效果,。

產(chǎn)品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，粗提物通過過濾柱除去內(nèi)毒素,，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽,、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除,，最后低鹽,、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點：

1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口特制吸附膜,，柱與柱之間吸附量差異極小,，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端,。

2.有的去蛋白液配方,，可以高效去除核酸酶,。即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除,。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解,。

3.特內(nèi)毒素清除方法，清除內(nèi)毒素效果一般小于<0.1 EU/μg,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一,、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制,。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板,、引物,、DNA聚合酶、DNA解旋酶,、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板,、引物,、PCR Buffer、Taq酶,、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增,；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開,，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應,。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平,。因此,，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應,， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min,、PCR產(chǎn)物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結(jié)合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構簡單，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋,。

公司正在出售的產(chǎn)品：

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2,、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。