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詳細(xì)介紹
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果,。
產(chǎn)品介紹：
在高離序鹽存在的情況下,，DNA片段選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,，漂洗液將引物,、核苷酸、蛋白,、酶等雜質(zhì)去除,，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫,。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1特的吸附柱設(shè)計(jì),，消除了液體殘留及污染,，并且洗脫體積低可至5μl。
2.使用了優(yōu)質(zhì)溶膠液,，不含傳統(tǒng)溶膠液的碘鈉和高氯酸鹽,，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應(yīng),。
3.獨(dú)的溶膠液/結(jié)合液配方,，將溶膠和結(jié)合兩種功能統(tǒng)一，因此一個(gè)試劑盒可以運(yùn)用于瓊脂糖DNA回收,、PCR產(chǎn)物清潔純化,、酶切產(chǎn)物純化回收等多種情況，節(jié)省了需購(gòu)買多種試劑盒的費(fèi)用,。
4.溶膠液/結(jié)合液調(diào)制成為了黃顏色,，便于觀察溶膠效果和監(jiān)測(cè)pH值變化從而達(dá)到最佳結(jié)合效果，大大提高回收效率,。
5.可回收50bp-25kb片段,，每個(gè)吸附柱可吸附DNA量為5μg。
適用范圍：
適用于瓊脂糖凝膠DNA回收,、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化回收,、酶切產(chǎn)物DNA片段純化回收、探針標(biāo)記后純化回收,、DNA樣品濃縮等,。
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-Hc2026 | 通用DNA純化回收試劑盒 | 100次 |
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：
一,、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。
二,、退火或稱接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘,。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度,。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
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PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1、變性溫度和時(shí)間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s,，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng),，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2、復(fù)性溫度和時(shí)間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。
3,、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間,。這里需要注意，延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間,。
4,、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加。
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