RNAlong RNA 長期保存液公司正在出售的產(chǎn)品：兔肝間質(zhì)細(xì)胞（永生化）　乙型肝炎病毒X抗原激活蛋白5封閉多肽　氣單胞菌通用PCR檢測試劑盒　大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)ELISA檢測試劑盒　ADPG焦磷酸化酶(AGP）酶活性比色法檢測試劑盒　新平滑曲霉　卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白28B抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！

保存條件：4℃。
產(chǎn)品介紹：
RNA性質(zhì)不穩(wěn)定，極易降解。溶解于無RNase的TE 或水中的純化RNA，即便是儲存于-20 oC也難免降解,。為解決這一問題，可以將RNA沉淀或RNA溶液溶解于RNA 長期保存液中,，允許RNA 4oC保存或-20oC至少保存1年而免于降解,。RNA長期保存液是RNA樣品運(yùn)輸和中長期保存的佳選擇,。需要時可用常規(guī)乙醇法沉淀回收RNA，或直接吸取儲存于RNA 溶解保護(hù)液中的高濃度RNA(可達(dá)4 mg/ml)進(jìn)行RNA 電泳,、Northern Blot,。
注意事項：
1. RNA 長期保存液可能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，做 RT-PCR 反應(yīng)前應(yīng)該用乙醇沉淀 RNA,。
2. 在 RNA 長期保存液中的 RNA 的終濃度不應(yīng)該超過 4μg /μl,。用 RNA 長期保存液溶解 RNA 沉淀：
1. 對固體 RNA 沉淀，每 0.4-4μg RNA 沉淀加入 1μl RNA 長期保存液,，反復(fù)吹打混勻或者室溫振蕩 15-30 min 溶解沉淀,。干燥的 RNA 沉淀難以溶解，可反復(fù)吹打混勻后 50oC 加熱 10-15 min,。最好先用小體積無 RNase 的TE 或水溶解 RNA 沉淀,，然后按液態(tài) RNA 操作。
2. 對液態(tài) RNA 溶液,，每 0.4-4μg RNA 溶液加入 1μl RNA 長期保存液,，混勻。注意混合液中 RNA 長期保存液的體積百分比不低于 80%,。
3. 測定 OD 值,。注意加入相應(yīng)量的 RNA 長期保存液做空白。
4. 將溶解的 RNA 樣品儲存于-20 oC 或者-70 oC,。從 RNA 長期保存液中沉淀 RNA：
1. 估計 RNA 溶液終體積,。加入 4 倍體積的無水乙醇，混勻,。如果溶液體積過小,，可加入 RNase free water 稀釋 RNA 溶液,如果溶液中 RNA 含量低于 0.25μg /μl，可加入 5M NaCl(RNase free) 至終濃度 0.2M,混勻后再加入 4 倍體積乙醇,。
2. 室溫放置 5 min,。
3. 12,000rpm 離心 5 min,棄上清,風(fēng)干，溶解,。
4. 重新沉淀的 RNA 溶解后可用于 RT-PCR 反應(yīng),。也可用于任何其他實驗。直接使用 RNA 長期保存液中的 RNA：直接吸取 RNA 長期保存液中的 RNA,，進(jìn)行普通或甲醛變性電泳和 Northern Blot,。進(jìn)行甲醛變性電泳時，最后上樣的樣品中的 RNA 長期保存液的濃度可高達(dá) 50%,。
附：甲醛變性電泳樣品準(zhǔn)備： 臨用前，混合水（87μl）,，甲醛（81μl）,，50%甘油/含 0.25 mg/ml 溴芬蘭(48μl ) 和20X MOPS (24μl). 將上述混合液和 RNA 長期保存液中的 RNA 樣品等體積混合,，55 oC 溫育 10 min，按照標(biāo)準(zhǔn)的甲醛變性電泳過程上樣,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作,。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。

二,、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘,。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s,，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：