測序后純化試劑盒 ( 磁珠法）公司正在出售的產(chǎn)品：人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞RFP熒光穩(wěn)轉(zhuǎn)株　重組人白介23 (活性的, Tag free)　節(jié)桿菌通用PCR檢測試劑盒　大鼠抗精子抗體(AsAb)ELISA Kit　β葡萄糖醛苷（βGD）活性比色法檢測試劑盒　畫眉草彎孢　間變性淋巴瘤激核相互作用伴侶蛋白抗體

商品屬性：

運輸保存：常溫運輸，建議4℃保存,。

PCR 后磁珠純化方法及步驟 ：

1.96孔反應(yīng)板從PCR儀下機后,，放入黑色的96孔板架上，配平,，在5810R離心機,，使用水平轉(zhuǎn)頭， 4000轉(zhuǎn)/分（4000rpm）離心一分鐘,。

2.從4℃冰箱中取出磁珠工作液,，手動或振蕩器充分震蕩磁珠液，使其重新懸浮,， 每孔加入磁珠液 5-10ul（建議使用5ul）,，再加入 70%乙醇 50ul,，蓋上膠墊，混勻后震蕩5分鐘,。

3. 將96孔反應(yīng)板放入96孔磁力板上放置3分鐘,，使磁珠吸附在孔底處或至溶液變清亮。

4. 帶磁力板棄上清（切記：樣品板不要離開磁方板）,，去掉膠墊，墊上吸水紙,，在5810R離心機上倒離心60 秒（300 轉(zhuǎn)/分）,。

5. 每孔加入 70%酒精50ul，蓋上膠墊,，重新震蕩懸浮,，放入96孔磁力板上放置3分鐘，使磁珠吸附在孔底處或至溶液變清亮,。

6.帶磁力板棄上清（切記：樣品板不要離開磁方板）,，去掉膠墊，墊上吸水紙,，在5810R離心機上倒離心60 秒（300 轉(zhuǎn)/分）,。

7.重復(fù)5、6步一次,。

8.每孔加入30ul 的滅菌后的超純水,，蓋上膠墊，震蕩使磁珠重新懸浮,。

9.在5810R離心機上正離心 10秒（300 轉(zhuǎn)/分）將側(cè)壁水珠離下即可,。

10.將96孔反應(yīng)板從磁力架上取下來，轉(zhuǎn)移到測序儀跑板專用磁力架上,，更換膠墊并扣緊,。

11.上機跑板（切記：上在帶有磁鐵的底座上，以免損壞毛細(xì)管）,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,，有模板,、引物、PCR Buffer,、Taq酶,、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增,；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開,，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng),。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平。因此,，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,，cDNA等，但不能為RNA,。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈,。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2,、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長,。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋,。

公司正在出售的產(chǎn)品：