2×HotStart Taq PCR MasterMix（含染料）公司正在出售的產(chǎn)品：人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫細胞　FAM149B1蛋白封閉多肽　禽病毒性關(guān)節(jié)炎PCR檢測試劑盒　大鼠可溶性CD40配體(sCD40L) ELISA檢測試劑盒　丙酮羧化（PC）活性比色法檢測試劑盒　局限曲霉　ISLR2蛋白抗體

商品屬性：

儲存條件：-20℃保存。

制品說明：

本產(chǎn)品包含HotStrat Taq DNA聚合酶,、dNTPs,、MgCl2、反應緩沖液，濃度為2×,。具有快速簡便,、靈敏度高、特異性強,、穩(wěn)定性好,、減少非特異擴增和引物二聚體等優(yōu)點,，可最大限度的減少人為誤差,。適用于復雜模板的擴增、多重PCR,、短鏈和長鏈DNA片斷的擴增,。產(chǎn)物可以直接用于T/A載體克隆,。

本產(chǎn)品使用方便快捷，能避免 PCR 操作過程中的污染,，使用時只需取適量2×HotStrat Taq PCR MasterMix溶液,，加入模板和引物，并加入去離子水補足體積,，使MasterMix溶液濃度為1×即可進行反應,。使用前請保證充分溶解并混勻，操作需在冰上進行,。

本產(chǎn)品含有兩種染料|（綠色染料和黃色染料）,，在電泳時會分開以監(jiān)測遷移進度。藍色的染料在1%的瓊脂糖凝膠中與3-5kb DNA片段的遷移率相同,。黃色的染料在1%的瓊脂糖凝膠中比引物遷移得快（＜50bp）,。

產(chǎn)品內(nèi)容：0.05units/μl HotStrat Taq DNA Polymerase (recombinant)、4mM MgCl2,、0.4mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

質(zhì)量控制：經(jīng)檢測無外源核酸酶活性,；PCR方法檢測無宿主殘余 DNA ；能有效地擴增人基因中的單拷貝基因,；室溫存放一周,，無明顯活性改變。

適用范圍：

基因檢測：本產(chǎn)品不同批次之間誤差很小,，特別適合大規(guī)?；驒z測，半定量PCR實驗和微量DNA的檢測,。

DNA擴增和一些有特殊結(jié)構(gòu)的復雜模板和GC含量高（>60%）,，有二級結(jié)構(gòu)等的擴增：DNA片段的PCR擴增、DNA標記,、引物延伸,、序列測定等,。PCR產(chǎn)物帶A，純化后可直接用TA載體克隆,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制,。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平,。因此，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應,， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min,、PCR產(chǎn)物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結(jié)合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：