平板涂布玻璃珠（無菌）公司正在出售的產(chǎn)品：耐長春新堿胃腺癌細胞　FAM118A蛋白封閉多肽　鵝包柔氏螺旋體PCR檢測試劑盒　大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)ELISA Kit　果膠裂解活性比色法檢測試劑盒　海岸海洋球菌　環(huán)指蛋白190抗體

商品屬性：

保存條件：室溫干燥保存
產(chǎn)品介紹：
平板涂布玻璃珠提供了一種高效快速的菌液（大腸桿菌,、酵母菌液等）涂布方法,。平板涂布玻璃珠（直徑4 mm）光滑均勻,，無菌包裝,，表面經(jīng)特殊工藝處理，不殘留菌液,。與傳統(tǒng)方法比較,，使用平板涂布玻璃珠，菌液涂布更加均勻,，并能夠覆蓋傳統(tǒng)涂菌方法不能達到的平板邊緣,。同時，可實現(xiàn)多板同時涂布,，大大提高實驗效率,。平板涂布玻璃珠可經(jīng)反復滅菌，多次使用,。
特點：
1. 均勻：菌液涂布均勻,。
2. 高效：可實現(xiàn)多板同時涂布。
3. 經(jīng)濟：可反復滅菌,，多次使用,。
滅菌方法：
玻璃珠經(jīng)70%的乙醇洗滌后，高溫高壓滅菌,，晾干后使用,。
使用方法：
1. 向已加入菌液的固體瓊脂平板加入無菌玻璃珠數(shù)顆，如9 cm平板每板建議加10粒玻璃珠,。
2. 蓋好板蓋,，于超凈臺表面水平前后、左右各快速晃動平板約10 sec,，以達到更佳涂板效果,。
注意：當板蓋有冷凝水時，應倒掉或晾干板蓋上的冷凝水,，以防止涂板時污染平板,。如需同時涂布多板，可將加有玻璃珠的平板疊在一起,，同時晃動涂板,。
3. 待瓊脂表面菌液干燥時，倒出玻璃珠,，蓋好板蓋,，以備后續(xù)培養(yǎng)。
注意：平板涂布玻璃珠為無菌包裝,，請在無菌環(huán)境下使用。玻璃珠可反復滅菌，多次使用,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內DNA的復制,。在生物體內DNA復制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內一樣,，DNA雙鏈打開，引物結合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應,。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平,。因此,，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應,， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,，cDNA等，但不能為RNA,。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡單,，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2,、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增),。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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