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詳細介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-Hc2220 | 2×SeamLess Mix | 20 次 ×10 |
保存條件：-20℃保存
產(chǎn)品介紹：
區(qū)別于拓撲克隆,、TA克隆和T4連接等常規(guī)克隆方法,，無縫克隆技術(shù)可在重組酶的作用下,，只需一步反應(yīng),，便可將片段克隆到任何載體中的任意位置得到重組質(zhì)粒,。無縫克隆技術(shù)作為一種非常強大的克隆技術(shù),，具有快速、簡便,、高效,、多片段組裝和定向克隆等特點，用于單個DNA片段的克隆,，多個DNA片段組裝克隆以及多位點突變構(gòu)建等實驗目的,。
產(chǎn)品特點：
1.簡單、快速,、精確,、定向克隆，連接過程只需要15分鐘,。
2.只需要簡單的PCR擴增就可以制備目的片段,，不需要內(nèi)切酶、連接酶和磷酸化酶,。
3.線性化載體的制備可以通過PCR擴增或選擇合適的內(nèi)切酶酶切,。
4.可以克隆長片段DNA,。
實驗原理
（下圖顯示兩個片段的組裝克隆過程）
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細胞,、組織、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂,、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,，可增強PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進行PCR反應(yīng)并得出準確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
一,、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。
二,、退火或稱接合,復性：
在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合,。該步驟時間1-2分鐘。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1,、變性溫度和時間：
保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2,、復性溫度和時間:
PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合。復性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加,。
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