pBM28 Toposmart 克隆試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：人肝癌細(xì)胞Luciferase熒光穩(wěn)轉(zhuǎn)株　氨基末端激2封閉多肽　貝巴魯病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠磷脂A2(PL-A2)ELISA檢測(cè)試劑盒　輔ⅡNADP(H)含量活性比色法檢測(cè)試劑盒　太平洋火色桿菌　環(huán)指蛋白92抗體

商品屬性：

保存條件：-20℃保存,。
產(chǎn)品介紹：
利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將PCR產(chǎn)物定向克隆到線性化的pBM28載體中。適用于克隆由Pfu,、sPfu,、KOD、Xerox,、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物,。pBM28 載體類似于公司的pENTR/D-TOPO入門載體， 具有attL1 和attL2,，為gateway系統(tǒng)中的入門載體,。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和測(cè)序鑒定。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
（1）連接反應(yīng)僅需 5 分鐘,。
（2）只適合平末端 PCR 產(chǎn)物的快速,、高效,、定向克隆,。
（3）載體采用了新的制備工藝，零背景,，無需藍(lán)白斑篩選。
（4）與pBM27載體相比,，pBM28載體無標(biāo)簽序列,。
（5）載體為壯觀霉su抗性。
注意事項(xiàng)：
（1）引物要求：PCR 引物5’端不能進(jìn)行磷酸化修飾,，普通商業(yè)化引物即可,。上游引物的5’ 端添加CACC 四個(gè)堿基（CACC 為真核表達(dá)所必需的Kozak 序列）。
（2）DNA 聚合酶：選用Pfu,、sPfu,、Phusion、Q5,、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 擴(kuò)增,。
（3）連接時(shí)間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘,。
（4）連接溫度：室溫 (22℃-37℃),，可使用PCR儀控溫。最佳反應(yīng)溫度為25℃,。若片段有高GC等復(fù)雜結(jié)構(gòu),，可在37℃反應(yīng)。
（5）產(chǎn)物要求：為保證PCR產(chǎn)物完整,，建議72℃后延伸5-10分鐘,。連接前使用瓊脂糖凝

PCR基本步驟及注意事項(xiàng),？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng),。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平,。因此,，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng),， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,，cDNA等，但不能為RNA,。對(duì)于不同類型的模板,，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識(shí)別DNA鏈,。

2.對(duì)于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響,，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增,。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行,。

1、擴(kuò)增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：