公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷！

描述：RNA 純化試劑盒的優(yōu)點為迅速僅需 5min 即可完成操作,，回收率可高達 70～95％。該試劑盒采用 高特異吸附能力的硅膠吸附柱,，應(yīng)用優(yōu)化好的特定緩沖 液,，可選擇性地結(jié)合回收目標 RNA，并去除雜蛋白,、鹽 等,。該試劑盒每次可純化得到高達 50 μg 的 RNA 片段 (>15nt),，回收的產(chǎn)物可直接用于 RT-PCR、用于 NGS 的 RNA 文庫制備,、基因編輯,、顯微注射、RNA 標記,、轉(zhuǎn)染 等,。

 組分

自備試劑：75%乙醇。
儲存：室溫保存,，有效期 2 年,。
操作方法
1. 向 50 µl 待回收樣品中加入 100 µl RNA CleanupBinding Buffer 用槍頭吹打混合均勻。
注意：若樣品不足 50 µl 需加入 RNase Free H2O 補至 50 µl,；若樣品大于 50 µl 則可按比例縮放緩沖液體積,，當樣品大于 150 µl 時應(yīng)上兩根吸附柱。
2. 向上述溶液中加入預(yù)冷 150 µl 無水乙醇（等體積）,，槍頭吹打混合均勻,。（當 15nt<RNA<25nt 時可加入 2倍體積的無水乙醇）。
3. 將上述溶液共 300 µl 加入到吸附柱中,，室溫靜置 30s,。4℃ 13,000rpm 離心 30s，棄去過柱液,。
4. 向吸附柱中加入預(yù)冷的 700 µl 75%乙醇,，4℃13,000rpm 30s，棄去過柱液,，重復(fù)此步驟一次,。
5. 13,000rpm 空離 2min 后，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml收集管中,，室溫放置 2min 使殘留乙醇揮發(fā),。
6. 向吸附柱芯中加入 50~100 µl RNase Free H2O，室溫靜置 1min 后,，4℃ 13,000rpm 離心 2min,，獲得的產(chǎn)物即為純化的 RNA?？闪⒓词褂没蛴?80℃保存,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細胞,、組織、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛,，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準,，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進行PCR反應(yīng)并得出準確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一,、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段,。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合,。該步驟時間1-2分鐘,。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2,、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。

3,、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：