Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit公司正在出售的產(chǎn)品：鮭魚胚胎細胞　磷化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2封閉多肽　河蟹顫抖病病毒PCR檢測試劑盒　大鼠上皮中性粒細胞活化肽78(ENA-78/CXCL5)ELISA Kit　尿氮活性比色法檢測試劑盒　快生芽孢桿菌　17號染色體開放閱讀框49抗體

商品屬性：

描述：本試劑盒采用穩(wěn)定高效的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系 5×Golden RT MasterMix 進行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，使用時只需加入模 板,、引物和 RNase Free H2O 即可，大大簡化了操作過程,、 提高了效率,、減少了操作過程中的人為誤差。具有快速簡便,、 重復(fù)性高,、特異性好、靈敏度高和穩(wěn)定性好的特點,。專用于 病毒 DNA/RNA 樣品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),。 該預(yù)混體系包含點突變致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP,、反應(yīng) Buffer 和 RNase Inhibitor,。該試劑盒采用的反轉(zhuǎn)錄酶去除了 RNase H 活性，從而避免反轉(zhuǎn)錄過程中降解 RNA,。同時經(jīng)過突變文 庫篩選,，使得其熱穩(wěn)定性更強，可耐受 55℃高溫反應(yīng),。相比 于低溫條件下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，采用高溫反轉(zhuǎn)錄可顯著打開 RNA 二級結(jié)構(gòu)，從而提高復(fù)雜 RNA 模板的擴增性能,、提高反轉(zhuǎn) 錄 cDNA 的長度和產(chǎn)量,，從而提高后續(xù)檢測的靈敏度,。合成 的第一鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成、雜交,、PCR 擴增、Real-Time PCR 反應(yīng)等,。

組分

儲存：請置于-20°C,，可保存 3 年；避免反復(fù)凍融,。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出現(xiàn)沉淀屬正?，F(xiàn)象，可用手捂化,，混合均勻后使用不影響實驗結(jié)果,。一步法 cDOn
1. 按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
病毒 DNA/RNA 樣品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反轉(zhuǎn)錄引物可根據(jù)需要改用特異性引物。
2.根據(jù)實際情況反轉(zhuǎn)錄可選擇快速程序或標(biāo)準(zhǔn)程序
快速程序
 37°C 15~30min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
標(biāo)準(zhǔn)程序
 25°C 10min（引物配對）
 55°C 30~60min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 實驗中使用快速程序進行反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄效率>80%）,，在進行高 GC 含量,、含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、長片段的模板轉(zhuǎn)錄時采用標(biāo)準(zhǔn)程序（反轉(zhuǎn)錄效率>100%）,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng),。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平。因此,，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,，cDNA等，但不能為RNA,。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2,、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

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