6min Fast 1st cDNA Synthesis Kit公司正在出售的產(chǎn)品：白鰱尾鰭細(xì)胞　甘肽還原封閉多肽　基孔肯尼雅病毒PCR檢測試劑盒　大鼠色上皮衍生因子(PEDF)ELISA檢測試劑盒　鳥氨轉(zhuǎn)氨（OAT）活性比色法檢測試劑盒　預(yù)研菌　16號染色體開放閱讀框48抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！

描述：本試劑盒采用穩(wěn)定高效的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混體系 5×Fast RT MasterMix 進(jìn)行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，使用時只需加入模板,、 引物和 RNase Free H2O 即可,，大大簡化了操作過程,、提高 了效率,、減少了操作過程中的人為誤差,。 該預(yù)混體系包含快速 MLV7 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP,、反應(yīng) Buffer 和 RNase Inhibitor,。該試劑盒采用的 MLV7 反轉(zhuǎn)錄酶 具有以下特性：RNase H 活性缺失，從而避免反轉(zhuǎn)錄過程中 降解 RNA,；經(jīng)過突變文庫篩選,，使得其熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，可耐 受 50℃ 高溫反應(yīng),，在 60℃ 條件下仍然具有 30%以上活性,， 利于打開 RNA 二級結(jié)構(gòu)，從而提高復(fù)雜 RNA 模板的擴(kuò)增性 能,；含有快速合成結(jié)構(gòu)域,，將 MLV 的延伸速度提高了 3-4 倍，因此適用于快速反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),；優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄 Buffer 系統(tǒng),， 可以獲得更高產(chǎn)量的 cDNA，從而提高后續(xù)檢測的靈敏度,。 合成的第一鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成,、雜交,、 PCR 擴(kuò)增、Real-Time PCR 反應(yīng)等,。

應(yīng)用：
（1）該制品可有效反轉(zhuǎn)錄 mRNA,、tRNA、LncRNA,、ncRNA
（2）該制品不可反轉(zhuǎn)錄 microRNA
組分

儲存：請置于-20°C,，可保存 3 年；避免反復(fù)凍融,。
1. 按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
Total RNA or Poly(A) RNA 0.1-2 μg
5×Fast RT MasterMix 4 μl
*20×Oligo dT(25)&Random Primer 1 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*注：反轉(zhuǎn)錄引物可根據(jù)需要改用特異性引物,。
2.反應(yīng)程序
 50°C 5 min（cDNA 合成）
 95°C 1 min（失活 MLV）
3. 采用 0.25-2μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為后續(xù)定量 PCR 或 PCR的擴(kuò)增模板即可,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作,。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一,、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合,。該步驟時間1-2分鐘,。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3,、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：