HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)公司正在出售的產品：小鼠纖維原細胞　骨形態(tài)發(fā)生蛋白9封閉多肽　牛布魯氏桿菌PCR檢測試劑盒　大鼠葡萄糖依賴性胰島釋放多肽(GIP)ELISA檢測試劑盒　精氨(Arg)檢測試劑盒　假堅強芽胞桿菌　1號染色體開放閱讀框83抗體

商品屬性：

末端轉移酶（TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶,，催化脫氧核苷酸結合到 DNA 分子的 3’羥基端,。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物,，加尾長度可達 5~300nt,。本酶經電子重構架技術篩選， 使其可以在 45°C 高溫下反應,，從而避免因 DNA 二級結構造 成的加尾效率下降,。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基（如 ddNTP,，DIGdUTP）標記 DNA 3’末端,、TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記技術（細胞凋亡的原位檢測）等試驗。

活性定義：37 ℃ 60 分鐘內,，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個活性單位
熱失活：75°C 20min,。
儲存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事項
1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失,。
2,、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子,、氯離子,、碘例子和磷酸根離子均對 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3,、DNA 末端 mol 數的計算,，長度為 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本試劑采用穩(wěn)定高效的 RT-PCR 預混體系,，是以 RNA 為模板進行一步法 RT-PCR 的專用試劑,。其原理為用基因特 異性引物進行反轉錄反應，獲得第一鏈 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一鏈 cDNA）,，再使 用基因特異性正向引物和反向引物進行 PCR 擴增，在同一 反應體系中一步完成從反轉錄到 PCR 的全部過程,。反應體 系中已含有電泳所需的指試劑（藍色和黃色）,，反應后可以 直接進行電泳。 在本試劑盒中,，將耐熱 M-MLV 反轉錄酶,、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 預混液,；反應 Buffer,、dNTP 以及 電泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加簡單便,，擴增產物可用于平端克隆和 DNA 測 序,。
主要優(yōu)勢：
? 耐熱M-MLV反轉錄酶可在55℃反應能更好的打開復雜二級結構，只需 10min 即可完成逆轉錄,。
? DNA 聚合酶為熱啟動型高保真酶,，能夠有效的抑制非特異性反應且具有較高的校正活性，酶激活僅需 2min,。
? 具有寬泛的模板量兼容性,，10 ng~1μg 都可有效擴增。
? 反應過程中無需開蓋,，避免了操作過程中的污染危害,。
組分
名稱 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
儲存：請置于-20°C，可保存 2 年,；避免反復凍融,。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，第一次使用之前要離心收集至反應管底部，吸取時應緩慢小心,。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶,，反應配制可在常溫進行，但各組分應-20°C 保存,。
實驗操作和反應條件：
1. 按以下組分配制反應液
RNA（病毒 DNA/RNA 樣品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特異性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特異性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超過 1 μg 的 RNA 模板量會抑制 PCR 反應,，建議第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根據結果進行優(yōu)化,。
2. 在 PCR 儀上按以下條件進行 RT-PCR 反應:
55°C,， 10min 逆轉錄反應
95°C， 2min 失活 M-MLV,，并激活高保真聚合酶
95°C,， 20s 30~40 cycles
TM°C， 20s
72°C ,，
2Kb/min
72°C,， 2min 末端延伸
3. PCR 反應結束后，可取 5 μl 產物直接進行電泳檢測,。預混液中已經包含綠色染料,，無需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 電泳時,，藍色指示劑指示 3~5 kb,，黃色指示劑指示<50 bp。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA,，如從細胞、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂,、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性,，從而提高反應效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物,；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴增產物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果,。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段,。

二,、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘,。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2,、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,，產物特異性越高,。復性溫度越低，產物特異性越低,。需根據引物的Tm值具體設定,。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應時間,，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現非特異擴增,。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4,、循環(huán)數:

其他參數選定后,，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數,。循環(huán)次數越多,，非特異擴增增加。

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