5min極速RNA提取試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：豬腎傳代細(xì)胞系　重組人VEGF121 (活性的, Tag free)　唇飾帶線蟲PCR檢測試劑盒　大鼠乳鐵傳遞蛋白/乳鐵蛋白(LF/LTF)ELISA檢測試劑盒　木質(zhì)過氧化物（LiP）活性比色法檢測試劑盒　堀越氏芽胞桿菌　14號染色體開放閱讀框130抗體

本試劑盒采用的裂解液,，可快速可靠的從細(xì)胞,、動物組織、植物組織,、病毒液樣本,、抗凝全血、培養(yǎng)細(xì)菌中純化出高純度的總 RNA,。該試劑盒是目前國際上操作步驟最少,、用時最短的 RNA 提取試劑盒（最快 5 分鐘）。應(yīng)用本試劑盒提取的 RNA 可直接用于反轉(zhuǎn)錄,、基因克隆,、定量檢測、文庫構(gòu)建,、雜交等多種分子生物學(xué)實驗,。
商品屬性：

注意事項：
(1) 本試劑盒中的 Washing Buffer 中已經(jīng)加乙醇，無需單獨添加,。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蝕性,，注意防護。操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中處理）培養(yǎng)細(xì)胞：消化完畢后,，離心收集細(xì)胞沉淀,，用 20~30μl 水或PBS 重懸細(xì)胞沉淀（務(wù)必重懸充分）。加入 120μl RNA LB1 漩渦混勻 30s(有未溶解的細(xì)胞團塊,，用槍頭吹打,，助溶解)，加入 500μlRNA BB2 上下顛倒混合均勻,，倒入吸附柱中,。13000rpm 離心 30s，倒掉廢液,，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟,。
組織樣品----采用研缽進行研磨：用液氮研磨粉碎組織樣本，將研磨粉碎的樣品加入到 200μl RNA LB1 中,，漩渦混合均勻 1min（有塊狀組織未溶解的,，要使用槍頭吹打，助消化）,，加入 500μl RNABB2 上下顛倒混合均勻,，13000rpm 離心 15s。將上清倒入吸附柱中（動作需輕柔,，勿將未消化的組織塊倒入吸附柱）,，13000rpm 離心 30s，倒掉廢液,，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟,。
組織樣品----采用鋼珠進行研磨：將組織樣品加入到 300μl RNALB1 中（1.5ml EP 管），并加入幾粒鋼珠,，置于組織研磨儀中,，研磨 1~2min。向研磨后的勻漿液中加入 750μl RNA BB2,，漩渦混勻5s,，13000rpm 離心 1min,。用 1ml 吸頭吸取 750μl 上清液到吸附柱中。13000rpm 離心 30s,，倒掉廢液,，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。注意：植物組織的勻漿效果通常較動物組織差一些,，所以一般推薦采用液氮條件下研缽來研磨,。在采用鋼珠研磨的條件下務(wù)必將組織研磨粉碎，否則會導(dǎo)致產(chǎn)率降低,。病毒液 /體液 /血清 /血漿：吸取 150μl 病毒液/體液樣品到加入到120μl RNA LB1 中,，漩渦混合均勻 30s。直接加入 500μl RNA BB2中,，漩渦混合均勻 15s,。倒入吸附柱中，13000rpm 離心 30s,，倒掉廢液,，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
培養(yǎng)細(xì)菌：收集菌體后,，用 20~30μl 水重懸菌體（務(wù)必重懸充分）,，加入 120μl RNA LB1 漩渦混勻 30s，加入 500μl RNA BB2 上下顛倒混合均勻,，倒入吸附柱中,。13000rpm 離心 30s，倒掉廢液,，進行后續(xù)洗滌/洗脫步驟,。
（2） 洗滌和洗脫
向吸附柱中加入 500μl Washing Buffer，13000rpm 離心 15s,。重復(fù)此步驟一次,。 將吸附柱重新放回離心機，13000rpm 空離心1min,，將殘留的乙醇甩干,。 將吸附柱芯放入到 2mL NucleaseFree 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50μl Nuclease Free H2O,，室溫放置 1min,，13,000rpm 離心 1min，洗脫液即為提取的 RNA,，冷凍保存,。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板,、引物,、PCR Buffer、Taq酶,、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增,；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開,，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸,，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達(dá)到較高水平,。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應(yīng),， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結(jié)合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

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