使用方法:

一,、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，*用帶芯槍頭，下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三,、設置 qPCR 反應（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線,。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照,。

操作流程:

收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質粒實物保存,。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途,！

PCR實驗方法步驟：

方法

1：在冰浴中,，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

10×PCR buffer

5 μl     dNTP mix （2mM）

4 μl     引物1（10pM）

2 μl     引物2（10pM）

2 μl     Taq酶 （2U/μl）

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）

1 μl      加ddH2O至 50 μl

產(chǎn)品特點：

◇高特異性：與其他病毒無交叉反應,，無非特異性擴增,；

◇高靈敏度：檢測靈敏度可達10~100拷貝；

◇操作簡便：該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,，可同時進行多個檢測,；

◇高通量：多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據(jù)標準曲線獲得定量結果,。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,，得到的Ct值是恒定的,。

2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此,，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法,。

外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,，重現(xiàn)性定量方法，已得到的*,，廣泛用于基因表達研究,、轉基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領域,。

定量PCR方法：

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）,。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。

b,、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,，下游引物不標記。在模板擴增的同時,，內(nèi)標也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測

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