商品屬性：

 對 T7 噬菌體啟動子具有高度的特異性，并可以其作為啟動子,，DNA 作為模板體外合成正義鏈,。雙鏈線性質粒 DNA,、PCR 產物均可作為該酶的底物模板。Hi T7 RNA 聚合酶經電子重構架及庫篩選,，與 Wild型比較來看,，酶的 DNA 模板結合區(qū)域親和力更高，使其具有持續(xù)合成能力,，從而獲得更高的產量,，并易于長片段RNA 的合成。該酶為重組純化制品,，無 DNase 和 RNase污染,。

活性定義：在標準反應體系下，37℃ 1 小時內將 1 nmol的 ATP 摻入酸不溶物所需要的酶量定義為一個活性單位,。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年,，如有白色沉淀析出，37°C溫浴 5min 后使用,，不影響性能,。
熱失活：75°C，10min,。

2. 37℃孵育 2-3h (通常 3h,，即可獲得>80 μg 的總產量)。
3. 反應完畢后,，如需去除模板 DNA,，加入 Dnase I（2U）37℃處理 15min。
4. 終止反應：75℃加熱 10min,，或加入 2 μl 0.5M 的 EDTA(pH8.0),。
注意事項
1.質粒DNA的質量影響RNA的量和完整性。質粒DNA的濃度越高,，生成RNA的質量越高,，質粒模板DNA應該無RNase污染.
2.該酶為高產酶，RNA 產量高,，在反應完畢后,，通常存在肉眼可見的渾濁狀態(tài)，其為反應副產物焦磷酸鎂,，此時表明反應劇烈,。在下一步 RNA 純化前，可通過短暫離心去除沉淀物，此過程并不丟失 RNA,。
3. 通常轉錄后 RNA 產物濃度在 2-4 μg/μl,，因此電泳時，僅需取 0.05-0.1 μl 即可,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內DNA的復制,。在生物體內DNA復制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer、Taq酶,、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增,；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開,，引物結合模板,，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應溫度實現的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上,，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍,。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平,。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數,，在平臺期前結束反應,， 減少非特異性產物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min,、PCR產物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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