商品屬性：

該酶是來源于 T4 噬菌體的 DNA 聚合酶,，又名 T4gp43，在 T4 噬菌體 DNA 復制過程中引導先導鏈和滯后鏈沿 5‘-3’方向延伸,。 通過點突變修飾 D219A，使得該酶失去 3’-5’ 外切核酸酶的活性，而保留了聚合酶活性，且該酶的聚合酶活性強于 DNA 聚合酶 I,。 與 DNA聚合酶 I 不同，T4 DNA 聚合酶不具有 5’ -3’ 核酸外切酶活性,。

活性單位定義：
一個活力單位即在 37°C 條件下，30 分鐘內(nèi)催化 10 nmoldNTP 的摻入反應成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量,。
儲存：-20℃可保存 3 年,。
10X T4 DNA Pol Buffer
200 mM Tris-HCl，pH7.9
500 mM NaCl
100 mM MgCl2
5 mM DTT
1mg/ml BSA
熱失活： 75°C,， 20 min
Storage Buffer：
20mM Tris-HCl,，pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
50% Glycero

PCR基本步驟及注意事項？

一,、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板,、引物,、DNA聚合酶、DNA解旋酶,、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板,、引物,、PCR Buffer、Taq酶,、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應,。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平,。因此,，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應,， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min,、PCR產(chǎn)物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡單,，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2,、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增),。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1,、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3,、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長,。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋,。

公司正在出售的產(chǎn)品：