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詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-PJ1095 | Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer | 100ml |
| 對目的蛋白進(jìn)行檢測分析時,，總蛋白的提取至關(guān)重要，如蛋白提取不好會導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)的不理想甚至失敗，如：信號極弱或無雜交信號,、背景高,、非特異性條帶多等.根據(jù)目標(biāo)蛋白的類型和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用種類來選擇合適的RIPA裂解液,，才能程度地保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。 Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer對細(xì)胞有一定的裂解能力,，能獲得較多的胞漿蛋白,，而對細(xì)胞核的裂解能力有限，不能裂解細(xì)胞核,，因此獲得的總蛋白適用于IP或CO-IP實(shí)驗(yàn),；而WB Super RIPA Lysis Buffer對動物組織和細(xì)胞的裂解能力強(qiáng)，它可以裂解細(xì)胞核和線粒體,，并可提取到更多的膜蛋白,，從而可獲得更多的總蛋白。因其強(qiáng)的裂解能力,，使得大量的基因組DNA從細(xì)胞核中釋放出來,，使蛋白變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決,。經(jīng)RIPA裂解液獲得得蛋白可用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,；使用Bradford法測定由本裂解液裂解所得到樣品的蛋白濃度會稍有誤差。 | ||
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| 1.可很好的釋放胞漿蛋白,，部分釋放膜蛋白和核蛋白,。 2.經(jīng)Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer，核蛋白與DNA還緊密 結(jié)合在一起,，離心后會造成核蛋白的丟失,。 3.對于膜蛋白，Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer的破壞力 小,，不能使膜蛋白與膜充分分離,，故離心后造成膜蛋白 的丟失。 4.在提取蛋白過程中,，基因組DNA釋放使得蛋白提取液 變的十分粘稠,，影響蛋白電泳和雜交效果。 | 1.可以很好的裂解細(xì)胞膜及細(xì)胞核,，從而更好的釋放胞漿蛋白,、核蛋白和膜蛋白。 2.對于核蛋白,，經(jīng)WB Super RIPA Lysis Buffer裂解后,，核蛋白與粘稠的基因組DNA分離,，離心后核蛋白存在于上清中，核蛋白的捕獲率高達(dá)90%,。 3.對于膜蛋白,，WB Super RIPA Lysis Buffer可大程度的破壞細(xì)胞膜和變性蛋白，使蛋白與膜分離,，防止蛋白與膜復(fù)合物在離心后沉淀,，從而防止蛋白丟失。 4.在提取蛋白過程中,，基因組DNA釋放使得蛋白提取液變的十分粘稠,，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。 | |
儲存 | ||
| 置于室溫陰涼處,，可保存2年,。 | ||
實(shí)例 | ||
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| Fig.用WB Super RIPA Lysis Buffer和Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer分別提取核蛋白PPARγ和膜蛋白PLD-1，上樣量分別為40ug和10ug總蛋白,，ECL發(fā)光液顯色,。A/C泳道為WB Super RIPA Lysis Buffer，B/D泳道為Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer,。由此圖比較分析表明WB Super RIPA Lysis Buffer能更充分的釋放核蛋白和膜蛋白,，從而獲得更強(qiáng)的信號。 | ||
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細(xì)胞、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
一、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。
二,、退火或稱接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘,。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1,、變性溫度和時間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2,、復(fù)性溫度和時間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。
4,、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。
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