商品屬性：

超敏 ECL 顯色液用于 Western,、Northern 和 Southernblot 分子雜交的化學發(fā)光檢測，比傳統(tǒng)化學顯色法靈敏度高,，可達 pg 水平,。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過氧化物酶反應時產生很強的發(fā)光信號,，在暗室中對X-光片感光,，以此檢測微量蛋白而獲得理想的實驗結果。?；鰪娦?ECL 顯色液具有靈敏度高,，持續(xù)時間長等特點。

應用
在 Western 印跡分析,，核酸雜交以及 EMSA 實驗中,，HRP標記的二抗或探針與靶分子結合再與底物反應產生可見光,。
儲存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存,。
操作方法（以 Western Blot 為例)
1．按每平方厘米膜面積用 0.1-0.2 ml 配置顯色液：根據(jù)顯色液的需要量,，取等體積 A 液和 B 液，混勻后避光保存?zhèn)溆?；該顯色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2．2. 取出膜,，平放在干凈的保鮮膜上,，膜的正面（蛋白質面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的顯色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 顯色液）,，溶液向四周迅速擴散,，覆蓋所有膜面。室溫保溫 5 分鐘左右,，在此過程中請仔細觀察信號的出現(xiàn),。注意：如果信號強，在暗室中能很快看到陽性信號出現(xiàn),。
3．3. 待信號出現(xiàn)且穩(wěn)定后,，用鑷子夾起膜，除去多余的顯色液,，平放在干凈的保鮮膜上,，膜的正面（蛋白質面）朝上，在轉移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜,，除去保鮮膜與轉移膜之間的空氣泡,，請務必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染,。
4．4. 在暗室中,，將膜的正面對著 X-光片，放入暗盒,。第一次曝光時間在 1 分鐘左右(有經驗的操作者可以根據(jù)信號的強弱自行決定),，立即按要求對 X-光片進行顯影和定影，確定最佳曝光時間,。曝光時間從數(shù)秒到數(shù)小時不等,；特別弱的過夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜較硝酸纖維膜能更好的結合蛋白,，因此呈現(xiàn)較強的信號,。選高質量的 PVDF 膜；盡可能不用 Nylon 膜,。
2.2.與抗體結合以后,，要保證膜處于濕潤狀態(tài),，否則會導致背景較高。
3.3.沒有信號的原因：有些抗體不識別變性抗原,，有時需要考慮電泳過程對蛋白質結構的影響,；樣品中無待測蛋白質或含量過低；一抗效價低,，用量少,，可適當增加一抗的用量；
4.4.背景過高原因：轉移膜封閉不充分,；與抗體孵育后洗滌,；膜在處理過程中過干；二抗用量過多等,。
5.5.注意及時更換顯影液,、定影液。

PCR基本步驟及注意事項,？

一,、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制,。在生物體內DNA復制需要模板,、引物、DNA聚合酶,、DNA解旋酶,、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板,、引物、PCR Buffer,、Taq酶,、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增,；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣,，DNA雙鏈打開,，引物結合模板，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上,，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平,。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min,、PCR產物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2,、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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