核酸外切酶I(E.coli)公司正在出售的產(chǎn)品：小鼠雜交瘤細(xì)胞　破傷風(fēng)毒重鏈封閉多肽　克羅諾桿菌通用PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠糖皮質(zhì)激受體α(GR-α)ELISA檢測(cè)試劑盒　糖原合成（GCS）活性比色法檢測(cè)試劑盒　斯氏魯杰氏菌　胰羧肽A6抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷！

該酶具有從 3’-5’ 方向降解單鏈 DNA 的外切酶活性,，能夠逐步釋放脫氧核糖核酸 5'單磷酸,，并留下完整的 5'端二核苷酸。該酶來(lái)源于攜帶有 E. coli exo I 基因的質(zhì)粒,，經(jīng)重組表達(dá)純化而得,。該酶多用于 PCR 擴(kuò)增后降解消化引物，該酶對(duì)于雙鏈 DNA 和磷?；蛞阴,；鶊F(tuán)封閉的 3’OH 末端 DNA 鏈無(wú)活性。

應(yīng)用
從 PCR 混合物中去除引物PCR 產(chǎn)物測(cè)序之前用于在單管中使用大引物進(jìn)行的PCR 誘變反應(yīng)從核酸混合物中去除含有 3'羥基末端的單鏈 DNA檢測(cè)含有 3'羥基末端的單鏈 DNA 的存在
儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年,。
活性定義：1 單位指在 37°C 條件下,，30 分鐘內(nèi)催化釋放10 nmol 的酸溶性核苷釋放所需要的酶量。
使用注意事項(xiàng)
（1）1×ExoI Buffer：67mM Glycine-KOH pH 9.5,，6.7mMMgCl2,，10mM 2-巰基yi醇。該酶在常規(guī) PCR Buffer 中也具有活性,。
（2）該酶的最佳反應(yīng)溫度為 37°C,，80°C 20min 可失活。
（3）該酶不能切割雙鏈 DNA,，因此含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA 需要變性后才能消化,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作,。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合,。該步驟時(shí)間1-2分鐘,。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min,、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2,、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。

3,、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間,。這里需要注意,，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：