描述：由于 miRNAs 分子序列較小,，僅 20nt 左右,，沒有 真核生物有的 Poly(A)尾巴結構,，采用傳統(tǒng) Oligo dT 引 物和隨機引物很難獲得從 miRNA 到 cDNA 的反轉錄產(chǎn) 物,。 公司開發(fā)出一套全新的加 A 法 miRNA 反轉 錄試劑盒,，基于 Peter 改良的 miR-Q 技術,， 可以對成熟的 miRNA 同時完成加 A 反應和反轉錄反應,， 直接獲得含有特異性 tag 和 15(T)的 cDNA 產(chǎn)物（如圖 1 所示）。該方法使得 miRNA 反轉錄與 mRNA 的反轉錄一 樣輕松,。直接將提取的 miRNA 與反應緩沖液混合物混合,， 并置于 PCR 儀上 1 小時即可獲得高濃度的、包含所有 miRNAs 分子的 cDNA 產(chǎn)物,。獲得的 cDNA 產(chǎn)物適用于 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行定量檢測,，該方法 已被大量文獻所采用。 

儲存：請置于-20°C,，可保存 2 年,；避免反復凍融
操作方法
1. 按以下組分配制反轉錄反應液
miRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg
4×One step miRNA RT Solution 5 μl
*10×miRNA RT Primer 2 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*特別說明： 10×miRNA RT Primer 引物為
5’-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，定量擴增
用特異性上下游引物進行擴增,，圖 2 是以 hsa-miR-21 為
實例說明特異性上下游引物的設計方法
2. 在 PCR 儀上按以下條件進行反應:
 37°C 60min
 95°C 5min
3. 獲得 cDNA 產(chǎn)物后使用 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行 miRNA 定量檢測,。

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷,！

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛,，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組,、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準,，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物,；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度,，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上,，才能進行PCR反應并得出準確結果,。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一,、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段,。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘,。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵,。加熱90~95°C, 30~60s,，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合,。復性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3,、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：