Taq DNA連接酶公司正在出售的產(chǎn)品：金黃地鼠皮膚成纖維細(xì)胞　微管相關(guān)絲氨/蘇氨白激樣封閉多肽　溶血梭狀芽孢桿菌PCR檢測試劑盒　大鼠視結(jié)合蛋白4(RBP-4)ELISA試劑盒　羥脯氨（HYP）活性比色法檢測試劑盒　棲珊瑚假交替單胞菌　20號染色體開放閱讀框141抗體

商品屬性：

描述：Taq DNA 連接酶是一種熱穩(wěn)定性連接酶,，能夠催化 磷酸二酯鍵的形成，使與同一互補靶 DNA 鏈雜交的兩條相 鄰寡核苷酸鏈的 5′-磷酸末端和 3′-羥基末端通過磷酸二酯 鍵相連,。該連接反應(yīng)只有當(dāng)兩條寡核苷酸鏈與互補靶 DNA 配對,，并且兩條寡核苷酸鏈之間沒有空隙的條件下才可 發(fā)生。因此,，可以用它來檢測單堿基替換,。在 45℃-65℃ 范 圍內(nèi),，Taq DNA 連接酶均有活性。該酶在 1XHiFi Taq Ligase Buffer 中具有的保真性連接,。

組分

應(yīng)用
雙鏈 DNA 切刻的修復(fù)
儲存：-20℃可保存半年,，長期儲存請置于 -70℃。
活性定義：1 單位指 50μl 反應(yīng)體系中,，45℃ 條件下,，15 分鐘內(nèi)能使 50% 的 1μg 經(jīng) BstEII 消化的 λDNA 片段（12bp 粘性末端）發(fā)生連接所需要的酶量。該酶也可以使用 1×Taq DNA Ligase Buffer20 mM Tris-HCl（pH 7.6）,，25 mM KAc,，10 mM Mg(Ac)2，10 mM DTT,，1 mM NAD 和 0.1% Triton X-100,，45℃ 溫育。 該酶需 NAD+ 作輔因子,，在 10×Taq DNA 連接酶緩沖液中已添加 NAD+,；為了延長 NAD+ 的半衰期，緩沖液應(yīng)于 -70℃ 貯存,。
使用方法
1,、配制如下反應(yīng)體系
DNA up to 1 µg
10×HiFi Taq Ligase Buffer 5 µl
Taq DNA Ligase 2 µl
滅菌水 up to 50 µl
2、45℃孵育 15min,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開,，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng),。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達(dá)到較高水平。因此,，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物，cDNA等,，但不能為RNA,。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點結(jié)合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2,、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：