ssDNA/RNA環(huán)化連接酶公司正在出售的產(chǎn)品：中華鱉脾臟成纖維細(xì)胞　磷化腺苷單磷活化蛋白激α1封閉多肽　肉毒梭狀芽孢桿菌PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠生長(zhǎng)激釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin) 試劑盒 ELISA　葡萄糖氧化（GOD）活性比色法檢測(cè)試劑盒　泊庫島食烷菌　19號(hào)染色體開放閱讀框24抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！

描述： ssDNA/RNA CircLigase 為熱穩(wěn)定的 DNA/RNA 連接 酶，不依賴于 ATP,，可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內(nèi) 環(huán)化,。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團(tuán)和 3’-OH 基團(tuán),。對(duì)于大于 15nt 的單鏈底物,，該酶 都能高效的連接。 

組分

活性定義：65°C 1h 條件下,，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物環(huán)化,，所需的酶量定義為 1Unit。
儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年,。
反應(yīng)實(shí)例
1. 按以下組分配制反應(yīng)液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 進(jìn)行環(huán)化反應(yīng),。
2. 失活反應(yīng)
反應(yīng)結(jié)束后，可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應(yīng),?；虿捎?br data-filtered="filtered" style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
使用注意事項(xiàng)：
(1) 環(huán)化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團(tuán),，3’端含有 OH,。
(2) 環(huán)化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時(shí)會(huì)極大抑制環(huán)化效率，甚至導(dǎo)致環(huán)化失敗,。因此建議底物為純化產(chǎn)物,。
(3) 由于本酶提高了耐熱性，在 65℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng),，在測(cè)試中 Betain 無益于連接效率提升,。
(4) 本酶主要進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化連接，分子間的連接未檢測(cè)到,。
(5) 本酶對(duì) ssDNA 和 RNA 的環(huán)化效率高,，多數(shù)情況下，90%以上的底物被環(huán)化,。未被環(huán)化的 ssDNA 可通過加入 5U的 Exonuclease I,，37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環(huán)化 ssDNA。未環(huán)化的 ssRNA,，將稍后給出去除方案,。
(6) 本酶可以連接 15nt 以上的核苷酸，更長(zhǎng)的產(chǎn)物連接參數(shù),，將稍后給出測(cè)試報(bào)告及 protocol,。
(7) 對(duì)于連接底物量較少的實(shí)驗(yàn)來講，推薦縮小體系,，而不是減少酶的用量,。在小體系實(shí)驗(yàn)時(shí)注意體系的蒸發(fā)，可加入礦物油以防止蒸發(fā),。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個(gè)循環(huán)之前,，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合,。該步驟時(shí)間1-2分鐘,。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng),，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3,、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間,。這里需要注意,，延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間,。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：