pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體公司正在出售的產(chǎn)品：非洲爪蟾腎細(xì)胞　附睪分泌蛋白4封閉多肽　豬瘟病毒疫苗株P(guān)CR檢測(cè)試劑盒　大鼠腎損傷分子1(Kim-1) ELISA檢測(cè)試劑盒　葡萄糖6磷（G6P)活性比色法檢測(cè)試劑盒　獨(dú)島極地桿菌　艾滋病病毒抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！

描述：pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù),，載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶,，當(dāng)加入 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后,，5 min 就可以完成連接反應(yīng),，連接陽(yáng)性率高,。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點(diǎn),，便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴(kuò)增的含“A"尾巴和高保真酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物的連接,，載體含有氨芐青霉抗性篩選標(biāo)記,。 

注意：RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長(zhǎng)期保存（>2 年）,，已經(jīng)溶解后,，請(qǐng)-60℃以下保存（3 個(gè)月）。
主要特征
（1）快速連接,，最快僅需 5min,；（2）操作簡(jiǎn)單，僅需加入載體和片段即可,；（3）無(wú)需藍(lán)白斑篩選,，陽(yáng)性率高；（4）不包含
任何酶切位點(diǎn),，便于后續(xù)亞克?。?）平末端和 A 尾產(chǎn)物通用,。
注意：引物不能磷酸化。
測(cè)序引物
正向測(cè)序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’,；
反向測(cè)序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’,；
操作步驟
1. PCR 產(chǎn)物的純化
1.1 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測(cè)產(chǎn)物,，如無(wú)非特異性擴(kuò)增,、無(wú)引物二聚體、條帶單一明亮,，則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑
盒純化后用于連接,。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進(jìn)行連接，但效果稍差一些,。
1.2 PCR 擴(kuò)增完畢后,，電泳檢測(cè)產(chǎn)物，如有非特異性擴(kuò)增條帶或引物二聚體,，則必須采用膠回收后用于連接,。
1.3 PCR 擴(kuò)增模板來(lái)源于 Amp 抗性質(zhì)粒，則必須采用膠回收后用于連接,。
2. PCR 用量和連接時(shí)間
PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時(shí)間 陽(yáng)性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應(yīng)
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl （用量參考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無(wú)菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后,，室溫（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min,。
關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說(shuō)明：在 PCR 產(chǎn)物回收后（在無(wú)法進(jìn)行 NanoDrop 測(cè)定濃度的情況下）,，按照一般的經(jīng)驗(yàn)可估算產(chǎn)物
的用量，原則為：3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后,，可清晰判斷的情況下,，使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物（約 5~15 ng）進(jìn)行連
接即可?；厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物（約 5~10 ng）進(jìn)行連接,。使用過(guò)高量的 PCR 產(chǎn)物將會(huì)導(dǎo)致連接效
率低下，長(zhǎng)斑數(shù)量和陽(yáng)性率急劇下降,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來(lái)判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一,、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。

二,、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘,。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度,。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s,，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3,、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間,。這里需要注意,，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間,。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：