rTEV蛋白酶公司正在出售的產(chǎn)品：MEF抗性的小鼠胚胎成纖維細胞,，經(jīng)射線處理,，P3,300萬細胞　鈣調(diào)節(jié)/鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)封閉多肽　棒桿菌通用PCR檢測試劑盒　大鼠(CA)ELISA Kit　性木聚糖活性比色法檢測試劑盒/性半纖維活性比色法檢測試劑盒　小紅卵菌　晶狀體蛋白2抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷！

rTEV 蛋白酶（重組型）是經(jīng)過基因工程改造后的重組蛋白酶,，該酶特異性識別 Glu-Asn- Leu-Tyr -Phe-Gln-Gly七氨基酸序列,，并高特異性、高活性剪切(剪切位點在Gln-Gly之間),。該酶經(jīng) 6×His 標簽純化而得(含組氨標簽),，純度達99％，剪切反應(yīng)完畢后可通過 Ni-NTA Resin )去除,。該酶在 4℃-30℃溫度,、pH 范圍（6.0-8.5）反應(yīng)條件下均具有活性（見下表）。

活性定義：在 1×rTEV Buffer（50 mM,，pH8.0, 0.5 mM EDTA,1mM DTT）,，30℃反應(yīng) 1h，剪切>85％的 3 μg 底物所需要的酶量定義為一個活性單位,。
應(yīng)用：融合蛋白標簽剪切去除,。
儲存：長期儲存-70℃，可儲存 2 年,，-20℃可儲存 6 個月,。
操作方法
1. 在 EP 管中配制如下反應(yīng)體系
融合蛋白 20 μg
20×rTEV Buffer 7.5 μl
0.1M DTT 1.5 μl
rTEV Protease 1-3 μl
ddH20 Up to 150 μl
2. 30℃孵育，在 1,、2,、4、6 小時分別吸出 30 μl 上述反應(yīng)液,，置于單獨的 EP 管中,。
3. 向上述 EP 管中加入 30 μl 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃,。
4. 樣品全部反應(yīng)完畢后,，樣品煮沸 5 min，取 40 μl 進行SDS-PAGE 分析,。
5. 如融合蛋白要求低溫處理,，可將反應(yīng)液置于 4℃，請延長反應(yīng)時間,，并增加 rTEV 酶用量,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細胞,、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二,、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合,。該步驟時間1-2分鐘,。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2,、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。

3,、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%,，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：