商品屬性：

來源于 E.coli,參與 DNA 損傷修復,。該酶可識別雙鏈 DNA 分子上的脫嘌呤/脫嘧啶（AP）位點，并切割 AP 位點 5′ 端的第一個磷酸二酯鍵,，產(chǎn)生 3′羥基和 5′ 脫氧核糖磷酸末端(deoxyribose phosphate,dRP),。另外該酶還具有 3′二酯酶活性，能從 DNA 的 3′末端釋放磷酸甘油醛,、完整的脫氧核糖 5′-磷酸和磷酸,。該酶的最佳底物為 AP 雙鏈 DNA，但對 AP 單鏈 DNA 也有一定活性。

儲存：置于-20°C 可保存 2 年,，避免反復凍融。
活性定義：一單位指在 10μl 反應體系中,，37°C 反應15min,，切割 1 pmol 含一個 AP 位點的 34mer 寡核苷酸雙鏈，所需要的酶量,。
1×Endo IV Buffer：20mM Tris-HCl,，pH8.5； 50mM KCl,；0.1% Tween20,；0.02% BSA, 5mM Mg2+。
熱失活：85°C,，20min,。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
使用方法
含 AP 位點的 DNA 2-20pmol
10X Endon IV Buffer 2 μl
Endonuclease IV (20 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
37°C 反應 15-30min,。

PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制,。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列,，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結合到模板上,，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應,。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,，達到較高水平。因此,，應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,，cDNA等，但不能為RNA,。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋,。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低,，則無需稀釋,。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2,、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：