甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg)公司正在出售的產(chǎn)品：人肺癌腺癌細(xì)胞　丁鹽反應(yīng)因子1封閉多肽　布魯塞爾德克酵母PCR檢測試劑盒　大鼠脫氫表雄酮(DHEA)ELISA Kit　土壤多酚氧化（SPPO）活性比色法檢測試劑盒　高大環(huán)柄菇　原鈣粘蛋白16抗體

商品屬性：

Fpg (formamidopyrimidine [fapy]-DNAglycosylase,，甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶）也稱作8-氧代niao嘌呤 DNA 糖基化酶,，既有 N-端糖基化酶活性也有 AP-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下雙鏈DNA 上受損的嘌呤堿基,，產(chǎn)生一個脫嘌呤（AP）位點(diǎn),。
AP-裂解酶活性可以切割 AP 位點(diǎn)的 3′ 或 5′ 端，因此可以除去 AP 位點(diǎn),，產(chǎn)生一個具有 3′ 和 5′ 磷酸的堿基缺口,。被 Fpg 識別并切除的受損堿基包括：7,8-二羥基-8-氧代niao嘌呤（8-氧代niao嘌呤）、8-羥基腺嘌呤,、fapyniao嘌呤,、甲基-fapy-niao嘌呤、fapy-腺嘌呤,、黃曲霉毒素B1-fapy-niao嘌呤,、5-羥基-胞嘧啶和 5-羥基niao嘧啶。

活性定義：1 單位指在 10 μl 反應(yīng)體系中,，37℃條件下,，1 小時內(nèi)能夠切割 1 pmol 含單個與胞嘧啶配對的 8-氧代niao嘌呤的 34 bp 寡核苷酸雙鏈所需要的酶量定義為一個活性單位。
熱失活：60°C，10min,。
反應(yīng)條件：10 mM Bis-Tris（pH 7.0）,，10 mM MgCl2 ，1mMDTT, 100 μg/ml BSA,，37℃ 溫育,。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年,，避免反復(fù)凍融,。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2,、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解,?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增),。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行,。

1,、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3,、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產(chǎn)物太長,。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物,。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋,。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一,、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板,、引物,、DNA聚合酶、DNA解旋酶,、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,，實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍,。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,，達(dá)到較高水平,。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺期前結(jié)束反應(yīng),， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二,、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,，cDNA等,，但不能為RNA。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量,。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開始,，兩個引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大,，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增,。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

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