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詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷,！
描述： 核酸外切酶 III 來(lái)源于 E.coli,，具有 3′-5′外切酶活性,，它作用于雙鏈 DNA,，從 3′ OH 末端方向逐步切去單核苷酸,；每次酶與底物結(jié)合催化,，只有幾個(gè)核苷酸被除掉,，從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)缺失。該酶的最佳底物為平末端,、5′突出末端雙鏈 DNA 分子,，但也可作用于雙鏈 DNA 的缺刻處，從 3′降解 DNA 分子,，釋放 5′單核苷酸,。對(duì)于 3′突出末端,，尤其是多于 4nt 的幾乎不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂鍵。核酸外切酶 III 的活性部分依賴螺旋結(jié)構(gòu),，并根據(jù)序列的不同 而有差異（C＞A=T＞G）,。另外，核酸外切酶 III 還具有脫嘌呤/嘧啶-核酸內(nèi)切酶活性,、RnaseH 活性和 3′磷酸酶活性,。
活性定義：50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 條件下,，30 分鐘
催化 E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的量定義為一個(gè)活性單位,。
應(yīng)用： 非定向巢式缺失定點(diǎn)突變鏈特異性探針的制備
制備用于雙脫氧測(cè)序的單鏈底模板
熱失活：70°C，20min,。
1X Exonuclease III Buffer: 10 mM Bis-Tris（pH 7.0）,，10
mM MgCl2，1 mM DTT,。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM
DTT, 25% Glycerol.
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年,，避免反復(fù)凍融。
活性定義：50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 條件下,，30 分鐘
催化 E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的量定義為一個(gè)活性單位,。
應(yīng)用： 非定向巢式缺失定點(diǎn)突變鏈特異性探針的制備
制備用于雙脫氧測(cè)序的單鏈底模板
熱失活：70°C，20min,。
1X Exonuclease III Buffer: 10 mM Bis-Tris（pH 7.0）,，10
mM MgCl2，1 mM DTT,。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM
DTT, 25% Glycerol.
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年,，避免反復(fù)凍融。
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-PJ1126 | Exonuclease III | 5000U |
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細(xì)胞、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來(lái)判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果,。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：
一、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。
二,、退火或稱接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘,。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度,。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1,、變性溫度和時(shí)間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2,、復(fù)性溫度和時(shí)間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時(shí)間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。
4,、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴(kuò)增增加,。
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