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詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷,！
描述：
核酸內(nèi)切酶 IV 來(lái)源于 E.coli,參與 DNA 損傷修復(fù),。該酶可識(shí)別雙鏈 DNA 分子上的脫嘌呤/脫嘧啶（AP）位點(diǎn),，并切割 AP 位點(diǎn) 5′ 端的第一個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生 3′羥基和 5′ 脫氧核糖磷酸末端(deoxyribose phosphate,dRP),。另外該酶還具有 3′二酯酶活性,，能從 DNA 的 3′末端釋放磷酸甘油醛、完整的脫氧核糖 5′-磷酸和磷酸,。
該酶的最佳底物為 AP 雙鏈 DNA,，但對(duì) AP 單鏈 DNA 也有一定活性。
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年,，避免反復(fù)凍融,。
活性定義：一單位指在 10μl 反應(yīng)體系中，37°C 反應(yīng)15min,，切割 1 pmol 含一個(gè) AP 位點(diǎn)的 34mer 寡核苷酸雙鏈,，所需要的酶量。
1×Endo IV Buffer：20mM Tris-HCl,，pH8.5,； 50mM KCl；0.1% Tween20,；0.02% BSA, 5mM Mg2+,。
熱失活：85°C，20min,。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1
mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.5,。
使用方法
含 AP 位點(diǎn)的 DNA 2-20pmol
10X Endon IV Buffer 2 μl
Endonuclease IV (20 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
37°C 反應(yīng) 15-30min,。
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 |
A-PJ1129 | Tth Endonuclease IV | 1000U |
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細(xì)胞,、組織、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來(lái)判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：
一,、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個(gè)循環(huán)之前,，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在,。該步驟時(shí)間1-2分鐘,，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
二,、退火或稱(chēng)接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃,。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合,。該步驟時(shí)間1-2分鐘。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈,。此階段的溫度依賴(lài)于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度,。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min,、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1,、變性溫度和時(shí)間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2,、復(fù)性溫度和時(shí)間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間,。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間,。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加,。
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