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詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷！
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-PJ1164 | 蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase） | 250U |
描述：
蔗糖磷酸化酶屬于糖基水解酶 13 家族,，是一種催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機(jī)磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖,。該酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖為供體,，多類物質(zhì)如多羥基的糖和糖醇,、酚羥基,、羧基等為受體,，催化合成各種糖苷 。 該 蔗糖磷酸化酶 （ SucrosePhosphorylase ） 通 過 重 組 制 備 而 得 ,， 其 催 化 蔗 糖（ sucrose ） 的 磷 酸 化 反 應(yīng) ,， 生 成 D-fructose 和α-D-glucose-1-phosphate，反應(yīng)式為：
Sucrose+Pi=α-D-glucose-1-phosphate+D-fructose,。該酶的比活>100U/mg,，該酶通過改造可耐熱,，反應(yīng)溫度可在 30~65℃進(jìn)行，最佳反應(yīng)溫度為 55℃,。在 60℃孵育 60h 后活性損失<30%,。
活性定義：1 單位指在 37°C,，pH 7.6 條件下，每分鐘由蔗糖催化生成 1.0 μmole 的 D-fructose 所需的酶量,。反應(yīng)緩沖液為 100mM KH2PO4，200mM Sucrose,，pH7.6。
保存：-20℃長期保存,。
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA,，如從細(xì)胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細(xì)胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過程,，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機(jī)化合物如甲醛,，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率,；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,，常常需要進(jìn)行酶切操作,。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
一、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段,。
二、退火或稱接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘,。
三、延伸：
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1、變性溫度和時間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2,、復(fù)性溫度和時間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高,。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3,、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間,。
4,、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加,。
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