公司產(chǎn)品僅供科研研究使用,、不得用于臨床診斷,！

純化自重組 E. coli 菌株,，攜帶從極度耐熱的 Thermococus litoralis 中克隆的無機焦磷酸酶基因,。該焦磷酸酶催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽,。–4 + H20 →2HP04–2,。該酶在 100°C 加熱 4h 仍然具有

100%活性,，因此可用于 PCR 反應(yīng)，解除生成的無機焦磷酸鹽對 PCR 的抑制,，增強 DNA 的復(fù)制,。

儲存：-20℃可保存 3 年。
活性定義：

1單位指標準反應(yīng)條件下：0.5ml反應(yīng)體系,，50 mMTricine pH8.5,，1 mM MgCl2 和 0.32 mM PPi，75°C 反應(yīng) 鐘,，每分鐘催化無機焦磷酸鹽生成 1μmol 磷酸鹽的酶量,。
使用注意事項：
（1） 該酶在多種反應(yīng) Buffer 中均具有活性，通常該酶在tHDA 擴增,、PCR,、測序反應(yīng)等實驗中，可直接接入即可,。
（2） 該酶的用量在不同的實驗中需要優(yōu)化,，通常在 5~50U/ml 濃度調(diào)整。
（3） 該酶不可以熱失活,。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞,、組織,、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物,，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂,、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等,，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,，可增強PCR反應(yīng)特異性,，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度,，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準確結(jié)果,。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘,，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二,、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后,，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合,。該步驟時間1-2分鐘。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合,。復(fù)性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3,、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間,。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4,、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加,。

公司正在出售的產(chǎn)品：