Tte uvrD解旋酶(20ug/ml)公司正在出售的產(chǎn)品：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞　鋅指蛋白433封閉多肽　腸出血性大腸桿菌血清型PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)ELISA檢測(cè)試劑盒　土壤有機(jī)碳（SOC）含量活性比色法檢測(cè)試劑盒　千葉類(lèi)芽胞桿菌　鋅指蛋白239抗體

商品屬性：

該蛋白來(lái)源于耐熱細(xì)菌,，該蛋白具有熱穩(wěn)定條件下解旋 DNA 的能力,。經(jīng)  測(cè)試,，本能解旋 5’突出,、3’突出和平端雙鏈 DNA,。該酶的解旋活性依賴(lài)于輔助因子 ATP 或 dATP,。該酶在 45-65℃條件下均有活性,，再高
的溫度導(dǎo)致酶失活,。該酶具有高的解鏈活性，因子其可潛在的用于 NanoPore測(cè)序,、芯片雜交,、或 tHDA 擴(kuò)增中，但以上功能 未予測(cè)試,。

儲(chǔ)存：-20 ℃ 可保存 3 年,。
使用注意事項(xiàng)：
（1） 該酶反應(yīng)液中需要添加 3mM ATP 或dATP 和>2mMMg2+。
（2） 該酶的功能性測(cè)試 1xBuffer 為,；20mM Tris-HCl,，pH7.6，50mM KCl,，10mM MgCl2, 3mM ATP,。由于應(yīng)用的差異，本制品不提供反應(yīng)緩沖液,。
（3） 在 20μl 反應(yīng)體系中,，dsDNA 2-5pmol，加入 10-20ng該制品,，反應(yīng)溫度推薦采用 60℃,，15-30min。由于底物的長(zhǎng)度或類(lèi)型的不同,，實(shí)驗(yàn)可能需要其它參數(shù)的調(diào)整,。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2,、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤,。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增),。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確,。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1,、擴(kuò)增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3,、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng),。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5,、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋,。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng),？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制,。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境,；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣,，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增,。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng),。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,，達(dá)到較高水平。因此,，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物,。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質(zhì)粒DNA,、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產(chǎn)物，cDNA等,，但不能為RNA,。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量,。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min,、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板,，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,，只能特意識(shí)別DNA鏈,。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng,。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響,，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋,。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,，且提取濃度一般較低,，則無(wú)需稀釋。

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