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詳細介紹
商品屬性：
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
一步染料法RT-qPCR試劑盒 | 100反應 | A-Tq3012 |
一步染料法RT-qPCR試劑盒 | 250反應 | A-Tq3012 |
一步染料法RT-qPCR試劑盒 | 500反應 | A-Tq3012 |
PCR 反應需要使用哪些試劑和設(shè)備,？
試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA,，如從細胞、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）,、脫氧胞嘧啶酸（dTTP）,，用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增,；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU,、Phusion等，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用,，調(diào)節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛,，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組,、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準,，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物,；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應溫度,，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸,。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學技術(shù)中均是,，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應并得出準確結(jié)果,。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：
PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
一、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離,。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段,。
二,、退火或稱接合,復性：
在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上,。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘,。
三,、延伸：
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶,。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒,、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。
PCR反應條件優(yōu)化：
1、變性溫度和時間：
保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵,。加熱90~95°C, 30~60s,，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。
2、復性溫度和時間:
PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合,。復性溫度越高,，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,，產(chǎn)物特異性越低,。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定,。
3、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增,。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。
4,、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少,，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,，非特異擴增增加,。
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