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PCR基本步驟及注意事項,？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制,。在生物體內DNA復制需要模板、引物,、DNA聚合酶,、DNA解旋酶、 dNTPs,；而體外PCR反應同樣需要類似的成分,，有模板、引物,、PCR Buffer,、Taq酶、dNTPs,。其中引物是人工設計的特定序列,，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境,；反應過程同生物體內一樣,，DNA雙鏈打開，引物結合模板,，延伸形成新鏈,。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的,。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸,，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增,。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍,。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應,。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平,。因此,，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝,。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,，主要包括基因組DNA,、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA,、PCR產物,，cDNA等，但不能為RNA,。對于不同類型的模板,，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,，質粒DNA2min,、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可,。

注意cDNA為單鏈DNA,，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,，合成另一條鏈,。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合,，從而實現了與常規(guī)PCR的接軌,。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,，只能特意識別DNA鏈,。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng,。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增,。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,，且提取濃度一般較低，則無需稀釋,。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1,、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3,、引物或探針降解,。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4,、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5,、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確,。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行,。

1、擴增效率低,。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2,、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等,。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4,、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5,、模板中存在抑制物,。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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