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PCR 反應需要使用哪些試劑和設備,？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA,，如從細胞,、組織,、血液中提取DNA等,；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物,；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）,、脫氧胸苷酸（dCTP）,、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂,、DNA合成等生物學過程,，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶,，一般使用Taq聚合酶,，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,，用于擴增DNA鏈,；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH,，硫代硫酸氫鹽SDS,、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性,，從而提高反應效率,；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,，常常需要進行酶切操作,。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具,。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物,；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制,；電泳槽：用于分離PCR擴增產物,；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,，只有在有序齊全的基礎上,，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成,，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一,、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷,。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,，僅以單鏈形式存在,。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段,。

二,、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃,。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合,。該步驟時間1-2分鐘。

三,、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈,。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度,。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min,、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒,。

PCR反應條件優(yōu)化：

1,、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈,。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害,。

2,、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,，產物特異性越高,。復性溫度越低，產物特異性越低,。需根據引物的Tm值具體設定,。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間,。引物小于16個核苷酸時,，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C,。延伸反應時間,，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠,；大于1kb需加長延伸時間,。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增,。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4,、循環(huán)數:

其他參數選定后,，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度,。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值,，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%,，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數,。循環(huán)次數越多,，非特異擴增增加。

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